（德國DRG進口原裝：EIA5071）

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DRG CA72-4 ELISA試劑提供的材料用于在人體血清或血漿中定量檢測腫瘤相關(guān)抗原CA72-4 （TAG-72）。本實驗僅供體外診斷使用,。

CA72-4（癌抗原72-4）zui初被描述為由B72.3識別的抗原因子,。B72.3是由相應(yīng)的原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移后的膜萃取物免疫雜交生產(chǎn)的鼠單克 隆抗體。CA72-4被證實是1MDa的粘液樣糖蛋白,，合成物稱為TAG72（腫瘤相關(guān)抗原72）,。TAG72蛋白的分子量為48KD. 血清和血漿中的CA72-4的水平升高見于某些惡性疾病，包括胰,、胃,、膽、結(jié)腸,、乳腺,、卵巢、子宮頸,、子宮內(nèi)膜的腫瘤,。它對胃腸道和卵巢的腫瘤有很高的診 斷學(xué)的敏感性。盡管在一些良性的疾病如風(fēng)濕病和卵巢囊腫也發(fā)現(xiàn)有CA72-4的升高，但是臨床研究表明,，對于胃腸道和卵巢腫瘤,，特異性診斷高達95％。 CA72-4的水平和腫瘤的大小及分級緊密關(guān)聯(lián),。CA72-4是胃腸道腫瘤的病人選擇治療學(xué)的監(jiān)測和隨后的護理的指標,。另外合適的指標是CA199和 CEA，另外,，CA72-4是卵巢腫瘤的病人選擇治療學(xué)的監(jiān)測和隨后的護理的可靠性指標,，尤其是對于CA125陰性的病人。

   DRG公司的CA72-4酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）,。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合CA72-4分子上*抗原位 點的單克隆小鼠抗體。一份含有內(nèi)源性CA72-4的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進行孵育,，該酶聯(lián)物是一種聯(lián)結(jié)有辣根過氧化物酶的抗CA72-4抗血清,。孵 育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物,。結(jié)合上的辣根過氧化物酶的總量與樣本中CA72-4的濃度成正相關(guān),。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中 CA72-4的濃度成正比,。

1）微孔板：12x8孔，可拆,，微孔中包被抗CA72-4 單克隆抗體,。

2）標準品（標準品0-4）：5支 0.5ml，即用,，濃度為0,3,，20，50,，100U/ml,，內(nèi)含無水銀防腐劑。

3）質(zhì)控高&低：2支 凍干粉,，0.5ml,，見“試劑準備”，質(zhì)控品的濃度及范圍請見試劑瓶標簽或質(zhì)控單,。內(nèi)含無水銀防腐劑,。

4）樣品稀釋液：一支，3ml,，即用,，內(nèi)含無水銀防腐劑,。

5）酶聯(lián)物：1支 14ml，標記辣根過氧化物酶的抗CA72-4抗體,，內(nèi)含無水銀防腐劑,。

6）TMB底物液：一支 14ml，即用,。

7）終止液：0.5M的硫酸,，一支 14ml，即用,，避免接觸終止液,，以免刺激或著燒皮膚。

8）洗滌液（40X）：一支 30ml.

注意：用于樣品稀釋的樣品稀釋液應(yīng)視需要而定,。

1）      酶標儀（450±10nm）。

2）      移液器

3）      吸水紙

4）      蒸餾水

5）      計時器

6）      坐標紙或是數(shù)據(jù)處理軟件

未開啟的試劑在2-8℃下儲存,，在保質(zhì)期內(nèi)保持其穩(wěn)定性。不要使用過期的試劑,。所有開啟了的試劑都應(yīng)在2-8℃下儲存,，微孔板需在2-8℃下儲存，一旦打開了微孔板的袋子,，需小心地將其重新密封,。

在使用前將所有的試劑和所需的板條平衡至室溫,。

質(zhì)控品：在凍干粉中加入0.5ml的蒸餾水使其復(fù)溶,，并至少放置10min，在使用前充分搖勻,。復(fù)溶后的質(zhì)控品需在-20℃下儲存。

  洗滌液：在30ml濃縮的洗滌液中加入1170ml的蒸餾水,，zui終洗滌液的容積為1200ml,。稀釋后的洗滌液在室溫下兩星期內(nèi)保持穩(wěn)定。

本實驗可使用血清或血漿（使用EDTA或肝素抗凝）樣品,，不要使用溶血﹑脂血﹑黃疸的樣品。注意：含疊氮鈉的樣品不能用于此實驗,。

7.1樣品采集

血清：靜脈采血,，允許使用凝血，在室溫下用離心法分離血清,。全血未*凝固前請勿離心,，接受了抗凝劑治療的病人血液可能需要更長的凝血時間。

血漿：將全血收集到含有抗凝劑的離心管內(nèi)，收集后馬上用離心法分離,。

7.2樣品的儲存

樣品蓋好蓋子后,，可在實驗前2-8℃下儲存5天，要更長時間儲存,，應(yīng)在-20℃下凍存,。在開始實驗前應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品。

7.3樣品的稀釋

在zui初的實驗中,，要是樣品的濃度高于zui高標準品,，則樣品應(yīng)用按實驗步驟所描述的10倍或100

倍稀釋。在計算濃度時需乘以此稀釋系數(shù),。

例子：

a）      按1：10稀釋： 10ul的血清+90ul的樣品稀釋液（充分搖勻）,。

b）      按1：100釋稀：10ul按a）稀釋的血清+90ul的樣品釋稀液（充分搖勻）

8.1總論

1）在使用前所有試劑和樣品均需平衡至室溫,，所有試劑要充分混合但不要起泡。

2）一旦實驗開始,，所有步驟都必須進行到底而不能中斷,。

3）對每種試劑﹑標準品和樣品使用一次性的吸嘴，以避免交叉污染,。

4）吸光率決定于溫育時間和溫度,，在開始實驗前，建議準備好所有的試劑,，將需要檢測的微孔板固定在板架上,，這些步驟保證每次加液步驟所需時間相同而沒有中斷。

5）按照一般的規(guī)律,，酶反應(yīng)時間與溫育時間和溫度成線性比例,。

8.2操作步驟

每次實驗都應(yīng)含有一條標準曲線

1）將實驗所需數(shù)目的板條固定在板架上。

2）用一次性吸嘴將20ul的標準品﹑質(zhì)控品和樣品加入相應(yīng)的檢測孔中,。

3）每孔加入100ul的酶聯(lián)物,。

4）*混合十秒，在此步驟里,，充分搖勻十分重要,。

5）不用封板，在室溫下溫育120分鐘,。

6）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物,，每孔用400ul洗滌液洗板五次，在吸水紙上用力拍板以除去殘留的液體,。注意：洗板步驟是否正確將直接影響到實驗的靈敏度和性,。

7）每孔加入100ul的底物液,。

8）在室溫下溫育30分鐘。

9）每孔加入100ul的終止液終止反應(yīng),。

10）            在加終止液后十分鐘內(nèi),，室溫下，于450nm處讀取吸光率,。

1）計算標準品﹑質(zhì)控品和病人樣品的平均吸光率。

2）以吸光率為Y軸,，濃度為X軸,，按照從標準品中獲得的平均吸光率和其相對應(yīng)的濃度值，繪制標準曲線,。

3）利用樣品的平均吸光率,，在標準曲線上得出其相應(yīng)的濃度值。

4）自動方法：使用立方函數(shù)﹑四參數(shù)模式或雙對數(shù)的計算機程序可得到結(jié)果,。

5）樣品的濃度可從標準曲線上直接獲取,。樣品的濃度高于zui高標準品的濃度則需進一步稀釋。在計算樣品的濃度的時候,，要乘以稀釋倍數(shù),。

下面是CA72-4 ELISA的標準曲線的典型例子。

 

 

 

本譯文僅供參考,，詳情請以原文為準,！

 

 

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