多巴胺ELISA Kit

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多巴胺ELISA Kit

（德國IBL：RE59161）

1,、應(yīng)用范圍

此試劑盒可用于人血漿和尿液中多巴胺的體外定量檢測，可手動(dòng)操作,，也可自動(dòng)操作,。進(jìn)一步的研究表明：此試劑盒還可用于組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液的研究。

2,、前言說明

兒茶酚氨類激素腎上腺素,、去甲腎上腺素和多巴胺主要由腎上腺髓質(zhì)、交感神經(jīng)系統(tǒng)和大腦產(chǎn)生,。它們幾乎影響所有的組織,，并與其它激素和神經(jīng)系統(tǒng)一起參與各種生理過程的調(diào)節(jié)。在許多疾病中,，兒茶酚氨激素及其代謝產(chǎn)物間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素的分泌量都會(huì)增加,，因而這些激素可用于疾病的診斷。所以,，這些激素的檢測對于疾病的診斷及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤疾病的具有重要意義,。它主要用于嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷，當(dāng)然也用于成神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤的診斷,。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)一開始時(shí)有提取步驟,，所以用戶可使用各種各樣的動(dòng)物材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果用此試劑盒測大鼠,、小鼠或其它動(dòng)物,，則兒茶酚氨的化學(xué)結(jié)構(gòu)與動(dòng)物的相同。

3,、實(shí)驗(yàn)原理

此固相酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)利用的是ELISA的夾心法,。微孔中包被了羊抗兔抗體,。在溫育時(shí)間之內(nèi)，加入的溶液抗在體可直接與抗原分子上的一個(gè)表位結(jié)合,。樣品中的抗原與酶標(biāo)二抗（可與抗原分子上的不同表位結(jié)合）在包被孔中溫育,。加入底物液后，溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中抗原的量成正比,。樣品的結(jié)果可直接用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定,。

4、貯存與穩(wěn)定性

試劑盒和運(yùn)輸環(huán)境和儲(chǔ)存環(huán)境溫度為2-8℃,，避免熱源或太陽直射,。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性及試劑的準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。開封的試劑盒在有效期內(nèi)穩(wěn)定,，前提是要將試劑盒用袋子密封并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下,。

5、樣品的采集與儲(chǔ)存

注意	人體內(nèi)的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會(huì)受到一些食品和藥物的影響,。因此在樣品采集前72小時(shí)內(nèi)病人應(yīng)禁止服用下列食物和藥品：維生素B,，咖啡，香蕉,，α甲基多巴,，MAO,，COMT抑制劑,，還有降血壓類藥物。

血漿（EDTA）

注意	血液采集后兩小時(shí)內(nèi),，將血液樣品冷藏于2-8℃的環(huán)境下直致離心獲取血漿,。
注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項(xiàng)。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測時(shí)都應(yīng)保持血液樣品的化學(xué)整體性,。不要使用明顯溶血,、黃疸血和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁,，則在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)當(dāng)離心以除去所有的微粒物質(zhì),。
貯存	2-8℃	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復(fù)凍融,，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品,。
穩(wěn)定性	6h	1個(gè)月

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。收集病人24h內(nèi)的所有尿液,，之后將其加入到10-15ml 6N的HCl防腐劑中,。
貯存	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復(fù)凍融,，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品,。
穩(wěn)定性	6個(gè)月

6,、試劑盒成分

注意	試劑盒所提供的試劑足夠做96孔單孔檢測或48孔雙份檢測。

注意	此包被板也可用于檢測腎上腺素,、去甲腎上腺素和多巴胺,。

數(shù)量	標(biāo)志	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆,，微孔中包被了抗兔IgG（羊,，單克隆）,。
1×6×2.5ml	CAL A-F	標(biāo)準(zhǔn)品A-F 腎上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml（0;8;27;82;273;819nmol/L）去甲腎上素:0;5.0;15;50;150;500ng/mL（0;30;89;296;887;2955nmol/L）多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL（0;78;228;750;2938;14688nmol/L）即用,內(nèi)含:腎上腺素-去甲腎上腺素-多巴胺（具有生物活性）,0.1M的HCl
1×2×2.5ml	CONTROL 1+2	質(zhì)控品1+2 即用,含: 腎上腺素-去甲腎上腺素-多巴胺（具有生物活性）,0.1M的HCl,具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標(biāo)簽.
1×250μL	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物濃縮型（100×）內(nèi)含：堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體,，Tris緩沖液，HCl,，0.01%的NaN3
4×	EXTRPLATE	提取板（微孔板）每板24孔,，包被了硼酸親和凝膠。
2×60ml	EXTRBUF	提取緩沖液粉紅色,，即用,，內(nèi)含：0.016%的NaN3
1×1.25ml	COMT LYO	COMT凍干粉內(nèi)含：兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（豬肝），NaN3
1×2ml	COMT ADD	COMT添加劑內(nèi)含：人血漿,，穩(wěn)定劑,，0.01%硫柳汞。
1×7ml	ANTISERUM DO	多巴胺抗血清紫羅蘭色,，即用,，內(nèi)含：抗多巴胺抗體（兔），緩沖液,，穩(wěn)定劑,。
2×1.25ml	COENZ	酶聯(lián)復(fù)合物即用，內(nèi)含：S-腺苷-L-蛋白酸,，穩(wěn)定劑,。
1×3ml	ENZBUF	酶緩沖液即用，內(nèi)含：Tris緩沖液,，HCl，穩(wěn)定劑,。
4×13ml	RELEASEBUF	Release緩沖液黃色,，即用，內(nèi)含：0.1M的HCl,，指示劑。
2×3ml	ACYLREAG	?；噭?/span> 即用,，內(nèi)含：二甲基甲酰胺,，乙醇,。注意：有毒，高可燃性,。
2×50ml	WASHBUR CONC	洗滌液濃縮型（10×）內(nèi)含：Tris緩沖液，HCl,，吐溫,，0.2%的NaN3
1×9×	PNPP SUBS	PNPP底物片內(nèi)含：對硝基苯磷酸（PNPP）
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液即用，內(nèi)含：二乙醇胺,，水,，0.05%的NaN3
1×15ml	PNPP STOP	PNPP終止液即用，內(nèi)含：1M的NaOH,，0.25M的EDTA
1×20ml	HCl	HCl 即用,，內(nèi)含：0.1M的HCl
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒不提供）

1）移液器（10,；10-100,；100-1000μL）

2）軌道搖床（200-900rpm）

3）旋渦混合器

4）帶儲(chǔ)器的8通道移液器

5）洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)包被板清洗系統(tǒng)

6）酶標(biāo)儀

7）雙蒸水或去離子水

8）吸水紙,，取樣吸頭,，計(jì)時(shí)器

9）樣品稀釋用試管。

8,、手動(dòng)操作

8.1實(shí)驗(yàn)前說明

注意	用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進(jìn)行。下列所述體積為做48人份時(shí)所需要的量,。
注意	試劑盒中的質(zhì)控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1：5的比例進(jìn)行稀釋（例如：20μL尿液+80μL 0.1M的HCl）,。標(biāo)準(zhǔn)品無需稀釋。

8.2樣品的稀釋

如果樣品中多巴胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)按照下列所述進(jìn)行稀釋：

樣品	待稀釋	稀釋液	備注
血漿	多巴胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品中多巴胺的濃度	雙蒸水	提取步驟前
尿液	多巴胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品中多巴胺的濃度	0.1N的HCl	提取步驟前

8.3樣品,、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的提?。ㄌ崛“澹?/span>

1）	將標(biāo)準(zhǔn)品、已稀釋好的質(zhì)控品,、已稀釋好的尿液樣品各20μL和500μL血漿樣品加入到提取板相應(yīng)的微孔中,。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入500μL雙蒸水以消除體積差別,。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液
3）	蓋板,。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取30min,。在提取過程中，液體的表面應(yīng)該會(huì)浸濕粘性金屬板,，但液體的量不能超過微孔的2/3,。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4）	移去粘性金屬板,，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,，在吸水紙上拍干。
5）	每孔加入2ml雙蒸水
6）	用新的粘性金屬板蓋板,。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min,。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
7）	移去粘性金屬板,，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,，在吸水紙上拍干。
8）	每孔加入150μL提取緩沖液,，再向每孔中加入50μL?；噭⒓椿旌暇鶆?。
9）	在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取20min,。（無需蓋板）
10）	快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干,。
11）	每孔加入2ml雙蒸水,。
12）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min,。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
13）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,，在吸水紙上拍干,。
14）	每孔加入300μL Release緩沖液。
15）	在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min,。（無需蓋板）

已準(zhǔn)備好的樣品應(yīng)當(dāng)在當(dāng)天就進(jìn)行檢測,。如果不行的話，您可將提取板用粘性金屬板蓋好,，在2-8℃的環(huán)境下可存放一夜,。

8.4凍干粉或濃縮成分的準(zhǔn)備

稀釋	成分		稀釋液	比例	備注	貯存	穩(wěn)定性
25ml	洗滌液	225ml	雙蒸水	1:10	充分混合	2-8℃	4W
60μL	酶聯(lián)物	6ml	洗滌緩沖液（已稀釋好）	1:101	臨時(shí)配置，僅能使用一次,，混合時(shí)避免氣泡產(chǎn)生	18-25℃	5h
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物液		臨時(shí)配置,，僅能使用一次	18-25℃	5h

9、實(shí)驗(yàn)步驟（手動(dòng)操作）

9.1 COMT酶溶液的準(zhǔn)備

注意：COMT酶溶液應(yīng)在使用前直接臨時(shí)配置

在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和,。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液,，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液zui后的體積為每支4.15ml,。一支可做48人份,。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產(chǎn)生,，配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時(shí),。

*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應(yīng)立即凍存于-20℃的環(huán)境下,。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個(gè)月,。

9.2樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的酶化

注意	如果使用自動(dòng)置換型移液器,，請將取樣吸頭內(nèi)的殘余液體加回到提取板相應(yīng)的微孔內(nèi),。將提取板置于一斜坡位置比較適當(dāng)。

科研用組織勻漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清可按如下建議處理：細(xì)胞培養(yǎng)上清必須根據(jù)其培養(yǎng)基及其相應(yīng)濃度進(jìn)行處理：根據(jù)尿液樣品的操作說明（至少提取20ul上清液）,，未稀釋樣品的靈敏度大概為1.0ng/ml,。如果基質(zhì)內(nèi)添加了血清（FCS），血漿（至少提取500ul上清）操作的靈敏度可以是5pg/ml,。無高氯酸的組織勻漿可用做勻漿樣品,，具體信息請咨詢IBL漢堡公司。

9.3檢測尿液和血漿中的多巴氨

1	在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液,，輕輕振蕩,。
2	在尿液樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的微孔中加入90μL Release緩沖液（血漿樣品孔除外）,。將已提取好的標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和尿液樣品分別10μL加入到相應(yīng)的微孔中。將100ul提取好的血漿樣品加入到相應(yīng)的微孔中,。在此加樣步驟中,，可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中。溶液顏色變成粉色,，輕輕振蕩,。
3	在每一微孔中加入50ul多巴胺抗血清（紫色）。
4	蓋板,，在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育120min
5	移去粘性金屬板，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次,。吸水紙上拍干以除去殘余液體。
6	在每一微孔中加入100ul臨時(shí)配置好的酶聯(lián)物。
7	蓋板,，在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育60min
8	移去粘性金屬板,，棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次,。吸水紙上拍干以除去殘余液體,。
9	如果可以的話，使用8道移液器加底物液和終止液,。加底物液和終止液的時(shí)間間隔應(yīng)當(dāng)相同,，使用自動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。
10	在每一微孔中加入200ul底物液,。
11	在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育40min
12	在每一微孔中加入50ul PNPP終止液,，輕輕振板以使溶液混合均勻。
13	加終止液后60min內(nèi)405nm處讀取OD值,。（參考波長：620-650nm）

10,、自動(dòng)操作步驟

10.1實(shí)驗(yàn)前說明

注意	用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進(jìn)行。下列所述體積為做48人份時(shí)所需要的量,。
注意	試劑盒中的質(zhì)控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1：5的比例進(jìn)行稀釋（例如：20μL尿液+80μL0.1M的HCl）,。標(biāo)準(zhǔn)品無需稀釋。

10.2樣品的稀釋

如果樣品中多巴胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)按照下列所述進(jìn)行稀釋：

樣品	待稀釋	稀釋液	備注
血漿	多巴胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品中多巴胺的濃度	雙蒸水	提取步驟前
尿液	多巴胺濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品中多巴胺的濃度	0.1N的HCl	提取步驟前

10.3樣品,、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的提?。ㄌ崛“澹?/span>

1）	將標(biāo)準(zhǔn)品、已稀釋好的質(zhì)控品,、已稀釋好的尿液樣品各30μL和750μL血漿樣品加入到提取板相應(yīng)的微孔中,。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入750μL雙蒸水以消除體積差別,。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液
3）	蓋板,。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過程中,，液體的表面應(yīng)該會(huì)浸濕粘性金屬板,，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
4）	移去粘性金屬板,，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干,。
5）	每孔加入2ml雙蒸水
6）	用新的粘性金屬板蓋板,。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
7）	移去粘性金屬板,，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,，在吸水紙上拍干。
8）	每孔加入150μL提取緩沖液,，再向每孔中加入50μL?；噭⒓椿旌暇鶆?。
9）	在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取20min,。（無需蓋板）
10）	快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，在吸水紙上拍干,。
11）	每孔加入2ml雙蒸水,。
12）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min,。液體是否濺出并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
13）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,，在吸水紙上拍干,。
14）	每孔加入450μL Release緩沖液。
15）	在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min,。（無需蓋板）

10.4凍干粉或濃縮成分的準(zhǔn)備

稀釋	成分		稀釋液	比例	備注	貯存	穩(wěn)定性
25ml	洗滌液	450ml	雙蒸水	1:10	充分混合	2-8℃	4W
150μL	酶聯(lián)物	15ml	洗滌緩沖液（已稀釋好）	1:101	臨時(shí)配置，僅能使用一次,，混合時(shí)避免氣泡產(chǎn)生	18-25℃	5h
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物液		臨時(shí)配置,，僅能使用一次	18-25℃	5h

11、實(shí)驗(yàn)步驟（自動(dòng)操作）

11.1 COMT酶溶液的準(zhǔn)備

注意：COMT酶溶液應(yīng)在使用前直接臨時(shí)配置

在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水,，充分混和,。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*,，COMT酶溶液zui后的體積為每支4.15ml,。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合,，但要避免氣泡產(chǎn)生,，配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時(shí)。

*如果只需要一定量的COMT溶液,，則剩余的COMT溶液應(yīng)立即凍存于-20℃的環(huán)境下,。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個(gè)月。

11.2實(shí)驗(yàn)步驟

在使用自動(dòng)方法做實(shí)驗(yàn)時(shí),，我們建議按1：10的比例預(yù)先稀釋提取好的標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和尿液樣品（如果是手動(dòng)操作則用Release緩沖液進(jìn)行稀釋）,。如果稀釋了,，第二個(gè)步驟可簡化為：將已提取好的血漿樣品,、已提取好的標(biāo)準(zhǔn)品（按1：10的比例預(yù)先稀釋）、質(zhì)控品和尿液樣品各100μL加入到微孔中,。在進(jìn)行預(yù)稀釋時(shí),，應(yīng)當(dāng)考慮到自動(dòng)操作的死容積。

1）在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液,，輕輕振蕩,。

2）在尿液樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的微孔中加入90μL Release緩沖液（血漿樣品孔除外）,。將已提取好的標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和尿液樣品分別10μL加入到相應(yīng)的微孔中。在此加樣步驟中,，可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中,。溶液顏色變成粉色，輕輕振蕩,。

3）每孔中加入50μL多巴胺抗血清,。

4）蓋板。在振蕩器（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下溫育120min

5）棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次,。

6）每孔加入100μL酶聯(lián)物

7）蓋板。在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下溫育60min

8）棄取孔內(nèi)反應(yīng)液,，用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次,。

9）加底物液和終止液時(shí)，其時(shí)間間隔應(yīng)相同

10）每孔加入200μL底物液

11）在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下溫育40min,。如果自動(dòng)操作時(shí)的溫度超過25℃時(shí),，則應(yīng)相應(yīng)的將溫育時(shí)間縮短至30min。

12）每孔加入50μL PNPP終止液以終止底物反應(yīng),，輕輕振蕩包被板以充分混合試劑成分,。

13）加終止液后60min之內(nèi)405nm處讀取OD值。（參考波長：620-650nm）

12,、期望值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作判斷任何治療結(jié)果的*因素,，疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀察和診斷檢測相結(jié)合。以下結(jié)果為正常人群的正常值（5%-95%）,，建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室讀確定自己的正常值范圍：

	尿液		血漿
	μg/d	nmol/d	pg/mL	nmol/L
多巴胺	＜600	＜3917	＜100	＜0.65

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