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生化分析儀常用分析方法

時(shí)間:2010-3-9閱讀:3111
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生化分析儀常用分析方法共有三大類,分別為終點(diǎn)法、固定時(shí)間法和動(dòng)力學(xué)法。

終點(diǎn)法: 指經(jīng)過一段時(shí)間的反應(yīng),,反應(yīng)達(dá)到平衡,由于反應(yīng)的平衡常數(shù)很大,,可認(rèn)為全部底物(被測物)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物,,反應(yīng)液的吸光度不再變化,只與被測物的濃度有關(guān),。這類方法通常稱為“終點(diǎn)”法,,更確切地說應(yīng)稱“平衡”法。

單試劑單波長終點(diǎn)法:t1時(shí)刻加入試劑(體積為V),,t2刻加入樣本

(體積為S),,然后攪拌并反應(yīng),之后開始測量反應(yīng)液的吸光度,,

在t3時(shí)刻反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn),,t3-t2為測定時(shí)間。

 

    反應(yīng)度R=At3-At2-1×V/(V+S),,或R=At3-ARBLK,。

 

    其中: Ati為i時(shí)刻的吸光度,ARBLK為試劑空白吸光度,。

單試劑雙波長終點(diǎn)法: 基本上同“單試劑單波長終點(diǎn)法”,,只是對(duì)于每一個(gè)測定周期,,其實(shí)際吸光度等于Aλ1-Aλ2。

雙試劑單波長終點(diǎn)法:t1時(shí)刻加入*試劑(體積為V1),,t2時(shí)刻加入                                      樣本(體積為S)之后立即攪拌,,t3時(shí)刻加入第二試劑(體積為V2)                                               并立即攪拌,,t4時(shí)刻反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn),。t3-t2為孵育時(shí)間,t4-t3為測定時(shí)間。

 

在項(xiàng)目參數(shù)中,,如果反應(yīng)起始時(shí)間設(shè)為0,,則反應(yīng)度R=A時(shí)刻吸光度-雙試劑空白吸光度。    如果反應(yīng)起始時(shí)間小于0,,則反應(yīng)度R=At4 -雙試劑空白吸光度-t3到t2間設(shè)定點(diǎn)的吸光度×(V1+S)/(V1+S+V2),。

雙試劑雙波長終點(diǎn)法: 基本上同“雙試劑單波長終點(diǎn)法”,只是對(duì)于每一個(gè)測定周期,,其實(shí)際吸光度等于Aλ1-Aλ2,。

固定時(shí)間法:又稱為一級(jí)動(dòng)力學(xué)法、二點(diǎn)動(dòng)力學(xué)法等,,指在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi),,反應(yīng)速度與底物濃度的一次方成正比,即v=k[S],。由于底物在不斷的消耗,,因此整個(gè)反應(yīng)速度在不斷的減小,表現(xiàn)為吸光度的變化越來越小,。這類反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間很長,,理論上可以在任意時(shí)間段進(jìn)行監(jiān)測,但由于血清成份復(fù)雜,,反應(yīng)剛啟動(dòng)時(shí)反應(yīng)較復(fù)雜,,雜反應(yīng)較多,必需經(jīng)過一段延遲時(shí)間才能進(jìn)入穩(wěn)定反應(yīng)期,。

t1時(shí)刻加入試劑(體積為V),,之后測量試劑空白的吸光度,t2時(shí)刻加入樣本(體積為S),,t3時(shí)刻反應(yīng)穩(wěn)定,,t4時(shí)刻停止對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測;t2-t3為延遲時(shí)間,,t3-t4為測定時(shí)間,。

單波長反應(yīng)度(單雙試劑相同):R=At4—At3

雙波長反應(yīng)度:R=(t4時(shí)刻主波長吸光度-t4時(shí)刻次波長吸光度)--(t3時(shí)刻主波長吸光度-t3時(shí)刻次波長吸光度)

動(dòng)力學(xué)法:又稱零級(jí)動(dòng)力學(xué)法,指反應(yīng)速度與底物濃度的零次方成正比,,也就是與底物濃度無關(guān),。因此,,在整個(gè)反應(yīng)過程中,反應(yīng)物可以勻速地生成某個(gè)產(chǎn)物,,導(dǎo)致被測定溶液在某一波長下吸光度均勻地減小或增加,,減小或增加的速度(ΔA/min)與被測物的活性或濃度成正比。動(dòng)力學(xué)法也被稱為連續(xù)監(jiān)測法,;主要用于酶活性的測定,。

    實(shí)際上,由于底物濃度不可能足夠大,,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,,底物消耗到一定程度后,反應(yīng)速度不再為零級(jí),,因此,,零級(jí)動(dòng)力學(xué)法是針對(duì)于特定時(shí)間段而言的;同樣,,由于血清成份復(fù)雜,,反應(yīng)剛啟動(dòng)時(shí)反應(yīng)較復(fù)雜,雜反應(yīng)較多,,必需經(jīng)過一段延遲時(shí)間才能進(jìn)入穩(wěn)定反應(yīng)期,,各試劑商對(duì)這兩段時(shí)間有嚴(yán)格規(guī)定。

t1時(shí)刻加入試劑(體積為V),,t2時(shí)刻加入樣本(體積為S),,t3時(shí)刻反應(yīng)穩(wěn)定,tn時(shí)刻停止對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測,;t3-t2為延遲時(shí)間,,tn-t3為測定時(shí)間。 單波長反應(yīng)度(單雙試劑相同)R=(n∑AT-∑A∑T)/[n∑T2-(∑T)2],其中:n=t3到tn間的數(shù)據(jù)個(gè)數(shù) ,,T=時(shí)間 ,, A=某一時(shí)間的吸光度。雙波長反應(yīng)度基本同單波長,,只是某一時(shí)間的吸光度等于主波長吸光度減去次波長吸光度,。

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