分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器,。常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量,。
　　分光光度計(jì)的簡單原理
　　分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源,，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源,，光源透過測試的樣品后,，部分光源被吸收，計(jì)算樣品的吸光值,，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
　　核酸的定量
　　核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能,?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈,、雙鏈DNA,，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260 nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一,，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù),。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA,，30μg/ml的Olig,。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度,。測試前,，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積,，爾后測試空白液和樣品液,。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
　　事實(shí)上,，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度,。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),，都是正常的,。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,，離子濃度等：在測試時(shí),，離子濃度太高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液，如TE,，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品,。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了zui大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A,，吸光值在0.1-1.,。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低,，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）。zui后是操作因素,，如混合要充分,，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值,；混合液不能存在氣泡,，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大,；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個(gè)操作事項(xiàng),。
除了核酸濃度,，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值,，用于評估樣品的純度,，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物，多肽,，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品,，A320一般是0。
　　蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）
　　這種方法是在280nm波長,，直接測試蛋白,。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法,，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液,，然后直接測試蛋白質(zhì),。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm 的“背景”信息,，設(shè)定此功能“開”,。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A,，*的線性范圍在1.0-1.5 之間,。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”,。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象,。事實(shí)上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%,，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù),，只要吸光值有少許改變,，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定,。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì),。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快，操作簡單,；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾；另外敏感度低,，要求蛋白的濃度較高,。
　　比色法蛋白質(zhì)定量
　　蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。
　　 比色方法一般有BCA，Bradford,，Lowry 等幾種方法,。
　　Lowry 法：以zui早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物,。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高,。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑,；反應(yīng)需要的時(shí)間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響,；含EDTA,，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法,。
　　BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+,，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長,。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定,。相對于Lowry法,，操作簡單，敏感度高,。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾,。
　　Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm,。其zui大的特點(diǎn)是,，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍,；操作更簡單,，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑,；化合物可以穩(wěn)定１小時(shí),，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry,，BCA