分光光度計

時間：2010-10-11閱讀：2846

分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸,，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。
　　分光光度計的簡單原理
　　分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置,，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后,，部分光源被吸收,，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度,。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比,。
　　核酸的定量
　　核酸的定量是使用頻率zui高的功能,。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,，單鏈,、雙鏈DNA，以及RNA,。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260 nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類型的核酸,，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig,。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前,，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液,。然而,，實驗并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者zui頭痛的問題,。靈敏度越高的儀器,，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
　　事實上,，的設(shè)計原理和工作原理,，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度,。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）,。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的,。另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時,，離子濃度太高，也會導(dǎo)致讀數(shù)漂移,，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液,，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果,。為了zui大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.,。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過低,，或者過高（超過光度計的測試范圍）。zui后是操作因素,，如混合要充分,，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值,；混合液不能存在氣泡,，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈,；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致,；不能采用窗口磨損的比色杯,；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度,，同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度,，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度,，因為蛋白的吸收峰是280nm,。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）,。如果比值低于1.8 或者2.0,，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子,。純樣品，A320一般是0,。
　　蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）
　　這種方法是在280nm波長,，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,，光度計可以直接顯示出樣品的濃度,，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度,。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單,，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì),。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),，一般要消除320nm 的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”,。與測試核酸類似,，要求A280的吸光值至少大于0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5 之間,。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時,，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象,。事實上,，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定,。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度,，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變,，濃度就會被放大,，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,，適合測試較純凈,、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,，速度快,，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,，如DNA的干擾,；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高,。
　　比色法蛋白質(zhì)定量
　　蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸,，絲氨酸）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì),。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度,。
　　比色方法一般有BCA,，Bradford，Lowry 等幾種方法,。
　　Lowry 法：以zui早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ),，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng),，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物,。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高,。缺點是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑,；反應(yīng)需要的時間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響,；含EDTA,，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法,。
　　BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是一種較新的,、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+,，后者與BCA形成螯合物,，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長,。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*,，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法,，操作簡單,，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾,。
　　Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng),，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點是,，敏感度好,，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單,，速度更快,；只需要一種反應(yīng)試劑,；化合物可以穩(wěn)定１小時，方便結(jié)果,；而且與一系列干擾Lowry,，BCA

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