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人神經(jīng)生長因子酶聯(lián)免疫分析（NGF）ELISA試劑盒使用說明書
閱讀：2806 發(fā)布時間：2010-2-24本試劑盒僅供研究使用
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定人血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中NGF含量,。
實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中NGF水平,。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入NGF抗原,、生物素化的抗人NGF抗體、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的NGF呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。
試劑盒組成及試劑配制
1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2.標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為1000 pg/mL，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成1000 pg/mL,，500 pg/mL ，250 pg/mL,，125 pg/mL,，62.5 pg/mL，31.2 pg/mL,，15.6 pg/mL,，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制500 pg/mL標準品：取0.5ml 1000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。
3.樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
4.檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。
5.檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
6.檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。
7.檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
8.底物溶液：1×10ml/瓶,。
9.濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10.終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
標本的采集及保存
1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃,，且應(yīng)避免反復凍融,。
2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?20℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融,。
3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或?qū)吮痉庞?20℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融。
注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
1.加樣：分別設(shè)空白孔,、標準孔,、待測樣品孔。除空白孔外,，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡，輕輕混勻,，酶標板加上蓋,，37℃反應(yīng)120分鐘。
2.棄去液體,，甩干,，不用洗滌。
3.每孔加檢測溶液A工作液 100ul,，37℃,60分鐘,。洗板3次，350ul/每孔,，甩干,。
4.每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃,，60分鐘,，洗板5次，甩干,。
5.依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）,。
6.依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。
注：
1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。
2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人NGF,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算
以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
注意事項
1．洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。
2．一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。
3．請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。
4．如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
5．在配制標準品、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。
6．底物請避光保存。
檢測范圍：
15.6 pg/mL -1000 pg/mL
說明
1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。
2．有效期：6個月
3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。
5．中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。