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技術(shù)：超聲破碎細(xì)胞常見問題
閱讀：9507 發(fā)布時(shí)間：2012-5-15 大腸桿菌表達(dá)外源蛋白,，在超聲破碎的時(shí)候,，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮,，然后超聲的效果較好,，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對(duì)其他的一些細(xì)菌同樣起作用,。
細(xì)菌沉淀直接加樣品1buffer,，再加5ul的巰基乙醇，混勻,，離心,，煮沸10min，直接上樣,，染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min,將染色液換成大量的水在微波爐煮10min 就可以.
在表達(dá)重組蛋白后超聲波破碎細(xì)胞,，采用冰浴，400w,，破2s停1s,，但是不一會(huì)就產(chǎn)生大量泡沫，影響了超聲波細(xì)胞破碎儀破碎功率,，pbs和tris緩沖液都是這樣,，zui后都是破碎不*，而的目的蛋白就在這些未破碎的細(xì)胞中,。
1,、會(huì)產(chǎn)生氣泡是因?yàn)槟愕奶筋^位置沒放好。探頭一定要接近底部,，約1cm,。功率根據(jù)超聲波細(xì)胞破碎不同會(huì)有所不同，但你可以觀察液面,，有波動(dòng)但不要太劇烈就好,。
2、破3S停10S,，破個(gè)二三十次看看,。
3,、變幅桿位置擺放也要注意，聽聲音如果不對(duì)的話就要及時(shí)調(diào)整,。另外可以從菌濃度方面考慮,。在破碎時(shí)試著加大體積,強(qiáng)度不要超過60%.
4、嘗試超8s停8s,對(duì)有些菌體蛋白來說,，你的方法很難散熱,，導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡，停頓時(shí)間稍長(zhǎng)一些,，這種情況多見于包涵體形式的蛋白,。
鏈霉菌超聲破碎的，用的方法條件是什么,？
1,、取細(xì)菌的24 h培養(yǎng)液于5000r／min下離心5 min收集菌體
2、用pH 7．5的Na2HPO-NaH2PO 緩沖液洗滌3次,，再用該緩沖液將菌體配成1：3的菌懸液．置于40 mL大塑料試管內(nèi)
3,、將大塑料試管置于冰浴中，采用超聲波破碎（功率200 W,，1／2”探頭,，破碎30 s，間歇30 S）
4,、破碎液于12 000 r／min下高速冷凍離心30 min,，收集細(xì)胞碎片和上清夜．
超聲破菌流程與上述基本一致，就是洗滌菌體也可以用預(yù)冷的生理鹽水或pH8的Tris－HCl,，洗滌一次就可以,。另外超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大,，超聲波細(xì)胞破碎儀的功率可以到400－600w,，超5s，停5s,，冰浴,，要加終濃度1 mM的PMSF。為確定合適的超聲強(qiáng)度和次數(shù),，有必要隨時(shí)鏡檢觀察菌體是否*破碎,。放線菌屬于原核生物系統(tǒng)進(jìn)化樹上的摩爾百分含量高的革蘭氏陽(yáng)性菌分枝類群，它雖然具有原核生物*的分子生物學(xué)特性,，但在其不同類群中,，細(xì)胞壁的化學(xué)組分變化大
在做大腸桿菌超聲時(shí)，采用的是400W,，超5停5的方法,，效果不錯(cuò),，但是用在鏈霉菌上，似乎沒什么效果,。會(huì)不會(huì)就是由于細(xì)胞壁組成差異造成的呢,，因?yàn)榇竽c桿菌式屬于革蘭氏陰性菌的。
再有鏡檢是檢驗(yàn)破碎效果,但是細(xì)胞破碎程度和我需要的酶獲得之間有正比關(guān)系嗎,？破碎時(shí)間長(zhǎng)也會(huì)影響到酶的活性,。所以想問問anaisai戰(zhàn)友，你提供的“功率200 W,，1／2”探頭,，破碎30 s，間歇30 S”的條件好像是用于破碎鏈霉菌孢子的,，也可以用于發(fā)酵離心后的菌泥嗎,？如果可以，你破碎的全程時(shí)間大概是多少呢,？
如果你需要的是胞內(nèi)酶,，細(xì)胞破碎程度和需要的酶獲得之間基本上有正比關(guān)系,。破碎時(shí)間長(zhǎng)的確會(huì)影響到酶的活性,。這就需要在*的破碎時(shí)間和酶活性之間做出判斷，zui直接的辦法是先繪制相關(guān)曲線,。
我的實(shí)驗(yàn)中,，破碎的是棒狀桿菌，破碎時(shí)間控制在30min左右,，酶活較好,。
如果是基質(zhì)菌絲的話,好可以考慮用溶菌酶處理一下。
一般來講這幾種方法讀可以的:
一,液氮研磨
二,用french press破碎
三,，超聲波破碎
四,，溶菌酶處理預(yù)處理
為什么用塑料大試管,玻璃的不可以嗎？
答：不可以的,。那么先讓我來解釋一下超聲波細(xì)胞粉碎儀超聲破碎的原理吧,。
超聲波是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機(jī)械波，它既是一種波動(dòng)形式,又是一種能量形式,。超聲對(duì)細(xì)胞的作用主要有熱效應(yīng),，空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。熱效應(yīng)是當(dāng)超聲在介質(zhì)中傳播時(shí),，摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動(dòng),，使部分能量轉(zhuǎn)化為局部高熱?？栈?yīng)是在超聲照射下,，生物體內(nèi)形成空泡,，隨著空泡震動(dòng)和其猛烈的聚爆而產(chǎn)生出機(jī)械剪切壓力和動(dòng)蕩。另外,，空化泡破裂時(shí)產(chǎn)生瞬時(shí)高溫高壓,，可使水蒸氣熱解離產(chǎn)生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化還原反應(yīng)可導(dǎo)致多聚物降解,、酶失活,、脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞殺傷。機(jī)械效應(yīng)是超聲的原發(fā)效應(yīng),，超聲波在傳播過程中介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)交替地壓縮與伸張構(gòu)成了壓力變化,，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。損傷作用的強(qiáng)弱與超聲的頻率和強(qiáng)度密切相關(guān),。所以如果使用玻璃管,，可能會(huì)碎裂，而通常使用的是塑料試管,。
100g大腸桿菌溶于1L破碎液里,，攪拌發(fā)現(xiàn)菌液發(fā)粘，菌體不能夠很好分散,，用超聲波細(xì)胞粉碎儀破碎,，加壓后，菌液不能進(jìn)入勻質(zhì)機(jī),，速度很慢,，請(qǐng)問是何原因？能有好的辦法解決,，很好用勻質(zhì)機(jī)快速破碎菌體,？
答：將破碎液的量加大，不能很好分散可能是量太大 ,，超聲處理5－10分鐘,，菌液粘度即可大大降低，也可促進(jìn)菌體分散,。不同型號(hào)的超聲波細(xì)胞破碎儀功率不一樣,，功率的大小決定了使用變幅桿的大小范圍，你使用多大的變幅桿就在設(shè)備的上調(diào)至該刻度,！變幅桿的大小決定了處理量5ml一下選3mm,，5～50ml可選6～8mm，50ml以上選10mm的變幅桿,，依此類推,！
酵母破碎的問題
答：一般的PROTOCOL都是用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎酵母細(xì)胞sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做過的方法中還是玻璃珠，效率很高,，而且對(duì)目的蛋白活性不會(huì)有什么影響,。一般應(yīng)該用這個(gè)方法,。 化學(xué)裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯,，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀,。此法的裂解效果不錯(cuò)的加尿素裂解液，在破碎遇到的問題是菌體濃度太低,，OD620nm在4-6之間,。細(xì)胞破碎儀的zui低破碎體積為4ml左右，這樣我再稀釋一倍,，我懷疑破碎完溶出蛋白和酶活測(cè)定時(shí)會(huì)測(cè)不準(zhǔn),。破碎后，你可將液體放入透析袋中濃縮
文章由順流超聲波細(xì)胞破碎儀提供