人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清,、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中BDNF含量,。

概述

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,，BDNF)是1982年德國神經(jīng)生物學(xué)家從豬腦中分離出來的小分子蛋白質(zhì)，因豬,、人,、小鼠和人類的BDNF具有*相同的氨基酸編碼序列，且與神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,，NGF）序列具有驚人的相似性,故被歸屬為神經(jīng)生長因子家族成員,。BNDF是由120個氨基酸組成的一種堿性蛋白，是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一,，是由神經(jīng)元的靶細(xì)胞分泌,，逆向營養(yǎng)神經(jīng)元，BNDF對神經(jīng)細(xì)胞的生長發(fā)育及保護(hù)修復(fù)有重要作用,其生物學(xué)效應(yīng)主要由二種類型的跨膜糖蛋白介導(dǎo),，一種是高親和力受體TrKB,，另一種是低親合力神經(jīng)營養(yǎng)素受體（LNGFR），其中TrKB是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的,。TrKB的細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)與BNDF結(jié)合后可發(fā)生自磷酸化,，繼而發(fā)生一系列底物磷酸化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的信息傳遞而引起細(xì)胞應(yīng)答效應(yīng), TrKB主要表達(dá)在腦中,。目前BDNF被認(rèn)為是抗凋亡劑,、抗氧化劑和鈣通道阻滯劑。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中BDNF水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入BDNF抗原,、生物素化的抗人BDNF抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的BDNF呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 
• 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10000 pg/mL,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成10000 pg/mL，5000 pg/mL ,，2500 pg/mL,，1250 pg/mL，625 pg/mL,，312.5 pg/mL,，156 pg/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制5000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。

• 樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。
• 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。
• 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。
• 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul）,，實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制。
• 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。
• 底物溶液：1×10ml/瓶。
• 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
• 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標(biāo)本的采集及保存 

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃,，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過一夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，為進(jìn)一步去除血漿中血小板，請再次2 - 8° C 1000 x g離心10分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：血小板中含BDNF,，并其將會隨著血小板的活化而釋放入血,。因此欲測定循環(huán)量BDNF量，須先盡量去除標(biāo)本中血小板,。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫,。

• 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。除空白孔外,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡，輕輕混勻,，酶標(biāo)板加上蓋,，37℃反應(yīng)120分鐘。
• 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。
• 每孔加檢測溶液A工作液 100ul,，37℃,60分鐘,。洗板3次，350ul/每孔,，甩干,。
• 每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃,，60分鐘,，洗板5次，甩干,。
• 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯）。
• 依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）,。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。

2．為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人BDNF,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項

• 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。
• 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
• 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。
• 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。

6．底物請避光保存,。

檢測范圍：

156 pg/mL -10000 pg/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。

5．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。