人白介素8(IL-8)ELISA試劑盒說明書
本試劑盒僅供體外研究使用
預期應用
ELISA法定量測定人血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中白介素8(IL-8/CXCL8)含量,。
概述
白細胞介素(IL-8)是1987年首先在受脂多糖刺激的人單核細胞培養(yǎng)液上清中分離提純的一種堿基肝素結合蛋白,具有內(nèi)源性白細胞趨化和活化作用,,zui初命名為單核細胞源性中性細胞趨化因子(monocyte-drvived neutrophils chemotactic factor, MDNCF),,1998年被正式統(tǒng)一命名為中性粒細胞活化肽/IL-8(NAP/IL-8)。IL-8屬于CXC型亞家族,。又因其氨基酸*個半胱氨酸前有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸而稱為ELR+-CXC型趨化因子,。IL-8是一種可由多細胞來源的多功能趨化因子,其生物學功能無種屬特異性,,除具有特異性使中性粒細胞離開血流游走到炎癥組織,,脫顆粒,產(chǎn)生超氧陰離子,,引起呼吸爆發(fā)外,,還顯示出促血管生成的活性,可參與多種惡性腫瘤的轉移及血管生成,。此外,,IL-8對淋巴細胞和其它免疫細胞也有趨化和活化作用。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板,,制成固相載體,,往包被抗IL-8/CXCL8抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗IL-8/CXCL8抗體,、HRP標記的親和素,,經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的IL-8/CXCL8呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計算樣品濃度,。
試劑盒組成及試劑配制
- 酶聯(lián)板:一塊(96孔)
- 標準品(凍干品):2瓶,,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,,然后反復顛倒/搓動以助溶解,,其濃度為5,000 pg/ml,將其稀釋為1,000 pg/ml后,,再做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),,分別稀釋1,000 pg/ml,500 pg/ml,,250 pg/ml,,125 pg/ml,62.5 pg/ml,,31.2 pg/ml,,15.6 pg/ml,樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml,,臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制500 pg/ml標準品:取0.5ml(不要少于0.5ml)1,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,,其余濃度以此類推,。
- 樣品稀釋液:1×20ml/瓶。
- 檢測稀釋液A:1×10ml/瓶,。
- 檢測稀釋液B:1×10ml/瓶,。
- 檢測溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(每孔100ul),,實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制,輕輕混勻,,在使用前一小時內(nèi)配制,。
- 檢測溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
- 底物溶液:1×10ml/瓶,。
- 濃洗滌液:1×30ml/瓶,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
- 終止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4)。
- 覆膜:1×5張
標本的采集及保存
- 血清:全血標本請于室溫放置2小時或4℃過一夜后于1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測,,或將標本放于-20℃或-80℃保存,,但應避免反復凍融。
- 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,,標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,,或將標本放于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融,。
- 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本:請1000 x g離心20分鐘,,取上清即可檢測,或將標本放于-20℃或-80℃保存,,但應避免反復凍融,。
注:以上標本置4℃保存應小于1周,-20℃或-80℃均應密封保存,,-20℃不應超過3個月,,-80℃不應超過6個月;標本溶血會影響zui后檢測結果,,因此溶血標本不宜進行此項檢測,;高血脂的標本不需進行特殊處理,可直接檢測,。
操作步驟
實驗開始前,,請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?/span>試劑或樣品稀釋時,均需混勻,,混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,,均應用樣品稀釋液進行稀釋,,以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前*行預實驗以建立*稀釋倍數(shù),。
- 加樣:分別設空白孔,、標準孔、待測樣品孔,??瞻卓准訕悠废♂屢?00ul,余孔分別加標準品或待測樣品100ul,,注意不要有氣泡,,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,,輕輕晃動混勻,,酶標板加上蓋或覆膜,,37℃反應120分鐘。
為保證實驗結果有效性,,每次實驗請使用新的標準品溶液,。
- 棄去液體,甩干,,不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(在使用前一小時內(nèi)配制),37℃,60分鐘,。
- 溫育60分鐘后,,棄去孔內(nèi)液體,甩干,,洗板3次,,每次浸泡1-2分鐘,350ul/每孔,,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干),。
- 每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul,37℃,,60分鐘,。
- 溫育60分鐘后,棄去孔內(nèi)液體,,甩干,,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,,350ul/每孔,,甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
- 依序每孔加底物溶液90ul,,37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),,此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,,即可終止),。
- 依序每孔加終止溶液50ul,終止反應,,此時藍色立轉黃色,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,,底物反應時間到后應盡快加入終止液,。
- 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進行檢測,。
注:
- 每次實驗留一孔作為空白調零孔(不同于空白孔),,該孔不加任何試劑,,只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零,。
- 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果,。所有試劑都必須在使用前達到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑,。
- 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。為防止樣品蒸發(fā),,試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),酶標板加上蓋或覆膜,,以避免液體蒸發(fā),;洗板后應盡快進行下步操作,避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài),。
- 消除板底殘留的液體和手指印,,否則影響OD值。
- 在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
- 未使用完的酶標板或者試劑,,請于2-8℃保存。標準品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,請配置標準品及工作液,,盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,,一次不要小于10ul),以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,;檢測液A,、B,以及底物溶液在使用前,,應置于37℃溫育30分鐘,;請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
- 建議檢測樣品時均設雙孔測定,,以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體,;在實驗臺上鋪墊幾層吸水
紙,,酶標板朝下用力拍幾次;將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),,浸泡1-2分鐘,,根據(jù)需
要,,重復此過程數(shù)次。
自動洗板:如果有自動洗板機,,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人白介素8(IL-8/CXCL8),且與其它相關蛋白無交叉反應,。
計算
以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),,OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,,如curve expert 1.3),,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,再乘以稀釋倍數(shù),;或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,,再乘以稀釋倍數(shù),,即為樣品的實際濃度。
注意事項
- 洗滌過程非常重要,,不充分的洗滌易造成假陽性,。
- 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,,推薦使用多道移液器加樣,。
- 請每次測定的同時做標準曲線,做復孔,。
- 如標本中待測物質含量過高,,請先稀釋后再測定,計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
- 在配制標準品,、檢測溶液工作液時,請以相應的稀釋液配制,,不能混淆,。
- 底物請避光保存。
檢測范圍:15.6 pg/ml - 1,000 pg/ml
zui低檢測限:7.8 pg/ml
說明
- 只有全部使用USCNLIFE試劑才能保證檢測效果,,因為所有試劑都是有關聯(lián)的,,不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守USCNLIFE試劑的試驗說明才會得到*的檢測結果,。
- 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,試劑避免受到微生物的污染,,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果,。
- 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本 / 標準品,酶結合物或底物時,,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,,將會導致不同的 “預孵育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。而且,,洗滌不充分將影響試驗結果。
- 試劑盒保存:短期(2周以內(nèi))以標簽上的標示為準,,長期保存請將試劑全部保存于-20℃,。
- 濃洗滌液會有鹽析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
- 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質,此為正?,F(xiàn)象,,不會對實驗結果造成任何影響。
- 中,、英文說明書可能會有不一致之處,,請以英文說明書為準。
- 所有的樣品都應管理好,,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
- 有效期:6個月