人白三烯D4（LTD4）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清、血漿,、細胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中LTD4含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中LTD4水平,。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入LTD4抗原,、生物素化的抗人LTD4抗體、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的LTD4呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。 

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 
• 標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成10000 pg/mL,，5000 pg/mL ，2500 pg/mL,，1250 pg/mL,，625 pg/mL，312.5 pg/mL,，156 pg/mL,，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制5000 pg/mL標準品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

• 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。
• 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。
• 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
• 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。
• 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。
• 底物溶液：1×10ml/瓶,。 
• 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
• 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。 

標本的采集及保存 

1．細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過一夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?/span>試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線,。如樣品濃度過高時，應(yīng)在試管中將樣品用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

• 加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘,。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。

• 棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘,。
• 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。 
• 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃,，60分鐘。
• 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
• 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)）（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）,。
• 依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。
• 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測,。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。 

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標板加上蓋或覆膜,。

3.  未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，不要一次用完,。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

4.  建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需

要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人LTD4,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。 

注意事項

• 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。
• 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。
• 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔,。
• 如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5．在配制標準品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：

156 pg/mL -10000 pg/mL

說明 

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。 

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。 

5．中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。