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人熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒使用說(shuō)明書
本試劑盒僅供研究使用
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測(cè)定人血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中人熱休克蛋白60(Hsp60)含量,。
實(shí)驗(yàn)原理
熱休克蛋白60(HSP60)是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)家族,。生理狀態(tài)時(shí)協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)的正確轉(zhuǎn)位,、折疊和裝配,,,起“分子伴侶”的作用,;在應(yīng)激狀態(tài)下,HSP60過(guò)表達(dá)或異位表達(dá),作為一種自身抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別,,誘發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答,,也可作為一種信號(hào)分子,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用.近年來(lái)研究證實(shí)HSP60在自身免疫性疾病,、傳染病、動(dòng)脈粥樣硬化及慢性感染的發(fā)病中均發(fā)揮重要的作用,。
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中HSP60水平,。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,,往包被單抗的微孔中依次加入HSP60抗原,、生物素化的抗人HSP60抗體、HRP標(biāo)記的親和素,,經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的HSP60呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度,。
試劑盒組成及試劑配制
如配制5000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml 10000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,,其余濃度以此類推,。
標(biāo)本的采集及保存
1.細(xì)胞培養(yǎng)物上清:請(qǐng)離心后收集上清,,并將標(biāo)本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2.血清:標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)一晚后于1000 x g離心20分鐘,,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,,但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,,或將標(biāo)本放于-20℃保存,,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。
操作步驟
各試劑在使用前平衡至室溫。
注:
1. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4,。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。
2.為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,;將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),,浸泡1-2分鐘,根據(jù)需要,,重復(fù)此過(guò)程數(shù)次,。
自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,。
特異性
本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人HSP60,,且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),,OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),,在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,;再乘以稀釋倍數(shù),;或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,,再乘以稀釋倍數(shù),,即為樣品的實(shí)際濃度。
注意事項(xiàng)
5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液工作液時(shí),請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,,不能混淆,。
6.底物請(qǐng)避光保存。
檢測(cè)范圍:
156 pg/mL -10000 pg/mL
說(shuō)明
1.試劑盒保存:-20℃(較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)),;2-8℃(頻繁使用時(shí)),。
2.有效期:6個(gè)月
3.濃洗滌液會(huì)有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。
4.剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),,此為正常現(xiàn)象,,不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。
5.中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不一致之處,,請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn),。
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