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廈門慧嘉生物科技有限公司
初級(jí)會(huì)員 | 第10年

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人熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒

時(shí)間:2016/3/1閱讀:147
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人熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒使用說(shuō)明書

本試劑盒僅供研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定人血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中人熱休克蛋白60(Hsp60)含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

熱休克蛋白60(HSP60)是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)家族,。生理狀態(tài)時(shí)協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)的正確轉(zhuǎn)位,、折疊和裝配,,,起“分子伴侶的作用,;在應(yīng)激狀態(tài)下,HSP60過(guò)表達(dá)或異位表達(dá),作為一種自身抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別,,誘發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答,,也可作為一種信號(hào)分子,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用.近年來(lái)研究證實(shí)HSP60在自身免疫性疾病,、傳染病、動(dòng)脈粥樣硬化及慢性感染的發(fā)病中均發(fā)揮重要的作用,。

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本HSP60水平,。用純化的抗體包被微孔板,制成固相抗體,,往包被單抗的微孔中依次加入HSP60抗原,、生物素化的抗人HSP60抗體、HRP標(biāo)記的親和素,,經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的HSP60呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度,。 

 

試劑盒組成及試劑配制 

  • 酶聯(lián)板:一塊(96孔) 
  • 標(biāo)準(zhǔn)(凍干品)2瓶,,每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后靜置10分鐘以上,,然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,,其濃度為10000 pg/mL,做系列倍比稀釋后,,分別稀釋成10000 pg/mL,,5000 pg/mL ,2500 pg/mL,,1250 pg/mL,,625 pg/mL,312 pg/mL,,156 pg/mL,,其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL,,臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制5000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品:取0.5ml 10000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,混勻即可,,其余濃度以此類推,。

  • 樣品稀釋液:1×20ml/,。
  • 檢測(cè)稀釋液A1×10ml/
  • 檢測(cè)稀釋液B1×10ml/,。
  • 檢測(cè)溶液A:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1:100稀釋,,稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制(每孔100ul),實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制,,輕輕混勻,在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
  • 檢測(cè)溶液B:1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測(cè)稀釋液B1:100稀釋,。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。
  • 底物溶液:1×10ml/瓶,。 
  • 洗滌液1×30ml/瓶,,使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
  • 終止液1×10ml/瓶(2N H2SO4),。 

 

標(biāo)本的采集及保存 

1.細(xì)胞培養(yǎng)物上清:請(qǐng)離心后收集上清,,并將標(biāo)本保存于-20℃,且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.血清:標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)一晚后于1000 x g離心20分鐘,,取上清即可檢測(cè),或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,,但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,,或將標(biāo)本放于-20℃保存,,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注:標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。

 

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

  • 加樣:分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔。除空白孔外,,余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul,,注意不要有氣泡,輕輕混勻,,酶標(biāo)板加上蓋,,37反應(yīng)120分鐘
  • 棄去液體,,甩干,,不用洗滌,。
  • 每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul37℃,60分鐘,。洗板3次,,350ul/每孔,甩干,。 
  • 每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul,,3760分鐘,,洗板5次,,甩干。
  • 依序每孔加底物溶液90ul,,37℃避光顯色30分鐘(此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯),。
  • 依序每孔加終止溶液50ul,,終止反應(yīng)(此時(shí)蘭色立轉(zhuǎn)黃色)。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值),。 

1. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,,該孔不加任何試劑,只是zui后加底物溶液及2NH2SO4,。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。 

2.為防止樣品蒸發(fā),試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。

洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,;在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層水紙,酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,;將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),,浸泡1-2分鐘根據(jù)需要,,重復(fù)此過(guò)程數(shù)次,。
自動(dòng)洗板:如果有自動(dòng)洗板機(jī),應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人HSP60,,且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)(對(duì)數(shù)坐標(biāo)),,OD值為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),,在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,;再乘以稀釋倍數(shù),;或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,,將樣品的OD值代入方程式,計(jì)算出樣品濃度,,再乘以稀釋倍數(shù),,即為樣品的實(shí)際濃度。 

注意事項(xiàng)

  • 洗滌過(guò)程非常重要,,不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性,。
  • 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),如標(biāo)本數(shù)量多,,推薦使用排槍加樣,。
  • 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,做復(fù)孔,。
  • 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高,,請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5.在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液工作液時(shí),請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,,不能混淆,。

6.底物請(qǐng)避光保存。

檢測(cè)范圍:

156 pg/mL -10000 pg/mL

說(shuō)明 

1.試劑盒保存:-20(較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)),;2-8(頻繁使用時(shí)),。

2.有效期:6個(gè)月

3.濃洗滌液會(huì)有鹽析出,稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。 

4.剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),,此為正常現(xiàn)象,,不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。 

5.中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不一致之處,,請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn),。

 

 

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