人熱休克蛋白60(Hsp-60)ELISA試劑盒使用說(shuō)明書

本試劑盒僅供研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定人血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中人熱休克蛋白60（Hsp60）含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

熱休克蛋白60（HSP60）是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白質(zhì)家族,。生理狀態(tài)時(shí)協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)的正確轉(zhuǎn)位,、折疊和裝配,,，起“分子伴侶”的作用,；在應(yīng)激狀態(tài)下，HSP60過(guò)表達(dá)或異位表達(dá),作為一種自身抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別,，誘發(fā)機(jī)體的保護(hù)性免疫應(yīng)答,，也可作為一種信號(hào)分子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用.近年來(lái)研究證實(shí)HSP60在自身免疫性疾病,、傳染病、動(dòng)脈粥樣硬化及慢性感染的發(fā)病中均發(fā)揮重要的作用,。

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中HSP60水平,。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入HSP60抗原,、生物素化的抗人HSP60抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的HSP60呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度,。 

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 
• 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成10000 pg/mL,，5000 pg/mL ，2500 pg/mL,，1250 pg/mL,，625 pg/mL，312 pg/mL,，156 pg/mL,，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制5000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

• 樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。
• 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶。
• 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶,。
• 檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1：100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
• 檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。
• 底物溶液：1×10ml/瓶,。 
• 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 
• 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。 

標(biāo)本的采集及保存 

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)一晚后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

• 加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔。除空白孔外,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul,，注意不要有氣泡，輕輕混勻,，酶標(biāo)板加上蓋,，37℃反應(yīng)120分鐘。
• 棄去液體,，甩干,，不用洗滌,。
• 每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘,。洗板3次,，350ul/每孔，甩干,。 
• 每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul,，37℃，60分鐘,，洗板5次,，甩干。
• 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘（此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）,。
• 依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時(shí)蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）,。 

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4,。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。 

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次,。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人HSP60,，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。 

注意事項(xiàng)

• 洗滌過(guò)程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性,。
• 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
• 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。
• 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高,，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

6．底物請(qǐng)避光保存。

檢測(cè)范圍：

156 pg/mL -10000 pg/mL

說(shuō)明 

1．試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）,；2-8℃（頻繁使用時(shí)）,。

2．有效期：6個(gè)月

3．濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。 

4．剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。 

5．中、英文說(shuō)明書可能會(huì)有不一致之處,，請(qǐng)以英文說(shuō)明書為準(zhǔn),。