人再生基因蛋白IV(REG-4)ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!
預期應用
ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關生物液體中REG-4含量。
實驗原理
用純化的REG-4抗體包被微孔板,,制成固相載體,,往微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的REG-4抗體、HRP標記的親和素,,經過*洗滌后用底物(TMB)顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的REG-4呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(值),計算樣品濃度,。
試劑盒組成及試劑配制
1,、 酶標板:一塊(96孔)
2、 標準品(凍干品): 2瓶,,請臨用前15分鐘內配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,蓋好后室溫靜置大約10分鐘,,同時反復顛倒/搓動以助溶解,,其濃度為200 ng/ml,然后做系列倍比稀釋(注:不要直接在板中進行倍比稀釋),,分別配制成200 ng/ml,,100 ng/ml,50 ng/ml,,25 ng/ml,,12.5 ng/ml,6.25 ng/ml,,3.12 ng/ml,,樣品稀釋液直接作為空白孔 0 ng/ml。如配制100 ng/ml標準品:取0.5ml (不要少于0.5ml )200 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,,混勻即可,,其余濃度以此類推。
3,、 樣品稀釋液:1×20ml,。
4、 檢測稀釋液A:1×10ml,。
5,、 檢測稀釋液B:1×10ml。
6,、 檢測溶液A:1×120 /瓶(1:100),。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋(如:10
檢測溶液A / 990
檢測稀釋液A),充分混勻,,稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100
/孔),,實際配制時應多配制 0.1-0.2ml,。
7、 檢測溶液B:1×120 /瓶(1:100),。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。
8,、 底物溶液:1×10ml/瓶,。
9、 濃洗滌液:1×30ml/瓶,,使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10、終止液:1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4),。
11,、覆膜:5張
12、使用說明書:1份
自備物品
1,、 酶標儀(建議儀器使用前提前預熱)
2,、 微量加液器及吸頭,EP管
3,、 蒸餾水或去離子水,濾紙
標本的采集及保存
1,、 血清:全血標本請于室溫放置2小時或4過一晚后于1000
g離心20分鐘,,取上清即可檢測,或將上清置于-20
或-80
保存,,但應避免反復凍融,。
2、 血漿:可用EDTA或肝素作為抗凝劑,,標本采集后30分鐘內于 1000g離心15分鐘,,取上清即可檢測,或將上清置于-20
或-80
保存,,但應避免反復凍融,。
3、 其它生物標本:請1000g離心20分鐘,,取上清即可檢測,,或將上清置于-20
或-80
保 存,但應避免反復凍融,。
注:以上標本均應密封保存,,4
保存應小于1周,-20
不應超過1個月,,-80
不應超過2個月,;標本溶血會影響zui后檢測結果,,因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前,,各試劑均應平衡至室溫,,試劑不能直接在37溶解;試劑或樣品配制時,,均需充分混勻,,混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量,,如樣品濃度過高時,,應對樣品進行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,,計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù),。
1、 加樣:分別設空白孔,、標準孔,、待測樣品孔??瞻卓准訕悠废♂屢?/span> 100 ,,余孔分別加標準品或待測樣品100
,注意不要有氣泡,,加樣 時將樣品加于酶標板底部,,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,,酶標板加上蓋或覆膜,,37
溫育2小時。為保證實驗結果有效
性,,每次實驗請使用新的標準品溶液,。
2、 棄去液體,,甩干,,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100(臨用前配制),,酶標板加上覆膜,,37
溫育1小時。
3,、 棄去孔內液體,,甩干,洗板 3次,,每次浸泡1-2分鐘,,大約400/每孔,,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
4,、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100,,加上覆膜,37
溫育1小時,。
5,、 棄去孔內液體,甩干,,洗板5次,,方法同步驟3。
6,、 每孔加底物溶液90,,酶標板加上覆膜37
避光顯色(反應時間控制在15-30分鐘,當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色,,后3-4孔梯度不明顯時,,即可終止)。
7,、 每孔加終止溶液50,,終止反應,此時藍色立轉黃色,。終止液的加入順序應盡量與底物 液的加入順序相同,。
8、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(值),。
注:
1、 試劑準備:所有試劑在使用前應平衡至室溫,,使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。實驗操作中請使用一次性的吸頭,避免交叉污染,。
2,、 加樣:加樣或加試劑時,*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,,將會導致不同的 “預溫育”時間,,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)控制在10分鐘內,。推薦設置復孔進行實驗,。
3、 溫育:為防止樣品蒸發(fā),,實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內,,以避免液體蒸發(fā),;洗板后應盡快進行下步操作,任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài),;同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度,。
4、 洗滌:洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干,,勿將濾紙直接放入反應孔中吸水,,同時要消除板底殘留的液體和手指印,避免影響zui后的酶標儀讀數(shù),。
5,、 試劑配制:Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理,以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用,,并使用相應的稀釋液配制,,不能混淆。請 配制標準品及工作液,,盡量不要微量配制(如吸取檢測溶液A時,,一次不要小于10),以避免由于不準確稀 釋而造成濃度誤差,;請勿重復使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液,。
6,、 反應時間的控制:加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如,每隔10分鐘),,如顏色較深,,請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應,避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù),。
7,、 底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射,。
洗板方法
1,、 手工洗板方法:將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內,浸泡1-2分鐘,,吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體,,在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,酶標板朝下用力拍幾次;根據(jù)需要,,重復此過程數(shù)次,。
2、 自動洗板:如果有自動洗板機,,應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人REG-4,且與其它相關蛋白無交叉反應,。
計算
各標準品及樣本 值扣除空白孔
值后作圖(七點圖),,如設置復孔,則 應取其平均值計算,。以標準品的濃度為縱坐標(對數(shù)坐標),,
值為橫坐標(對數(shù)坐標),在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,,如 curve expert 1.3,根據(jù)樣品
值,,由標準曲線查出相應的濃度,,乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與
值計算出標準曲線的回歸方程式,,將樣品的
值代入方程式,,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),,即為樣品的實際濃度,。
檢測范圍:3.12 ng/ml - 200 ng/ml,繪制標準曲線請取用以下濃度值:200 ng/ml,,100 ng/ml,,50 ng/ml,25 ng/ml,,12.5 ng/ml,,6.25 ng/ml,3.12 ng/ml,。
zui低檢測限:0.78 ng/ml
說明
本產品可能存在一定的質量技術風險,。
準備充足的標本備份,。
3,、 在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的 污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果,。
4,、 試劑盒保存:請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20,,其余試劑短期保存請置于4
,,長期保存則置于-20
。開封后的酶標板要密封加干燥劑后保存于-20
,,避免潮濕,。
5、 濃洗滌液會有鹽析出,,稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
6、 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質,,此為正?,F(xiàn)象,不會對實驗結果造成任何影響,。
7,、 有效期:6個月。
8,、 本操作說明適用于48T試劑盒,,但48T試劑盒所有試劑減半。
廈門慧嘉生物科技有限公司專業(yè)代理眾多生命科學領域的,。致力于各種ELISA試劑盒,、免疫組化試劑盒、一抗二抗,、細胞因子,、生物試劑、移液器,、耗材的銷售推廣及服務工作,。
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