人Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面抗原(KL-6)ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用

產(chǎn)品編號：CSB-E12700h

檢測范圍：78 U/ml - 5000 U/ml

zui低檢測限：19.5 U/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人KL-6,，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期：6個月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清,、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中KL-6含量,。

說明 

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。 

3．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

概述

   Ⅱ型肺泡細(xì)胞表面抗原（KL-6, Krebs Von den Lungen-6）是Kohno等在1985年發(fā)現(xiàn)的，為一種肺腺癌相關(guān)抗原,，它是一種大分子量糖蛋白,。KL-6由MUC1基因編碼，相對分子質(zhì)量接近200000,。在正常肺組織中,，KL-6在II型肺泡細(xì)胞，呼吸性細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和支氣管腺漿液細(xì)胞上表達(dá),。血清KL-6可反映肺泡損傷,，II型肺泡細(xì)胞再生和多種間質(zhì)性肺疾病的活動度。 

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體,，往包被抗KL-6抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗KL-6抗體,、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的KL-6呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。 

試劑盒組成及試劑配制 

• 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。 
• 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2瓶(凍干品),。
• 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。
• 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶,。
• 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶,。
• 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）
• 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）
• 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 
• 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。 
• 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

• 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
• 高速離心機
• 電熱恒溫培養(yǎng)箱
• 干凈的試管和Eppendof管
• 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時,，用多通道移液器

6. 蒸餾水,，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存 

• 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
• 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
• 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測,。

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi),，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的,。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄,。zui后計算濃度時,，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”,。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為5000 U/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋5000 U/ml，2500 U/ml,，1250 U/ml,，625 U/ml,，312 U/ml，156 U/ml,，78 U/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 U/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制2500 U/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）5000 U/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

• 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘,。

為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

• 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。
• 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔,，甩干。 
• 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl,，37℃,，60分鐘。
• 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，200μl/每孔，甩干,。
• 依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔顯色不明顯,，即可終止）。
• 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
• 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時,，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。 

3. 為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,。

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液,、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液,、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。

5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。 

注意事項

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡,。

2. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。

5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。

7. 底物請避光保存,。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。

廈門慧嘉生物科技有限公司專業(yè)代理眾多生命科學(xué)領(lǐng)域的。致力于各種ELISA試劑盒,、免疫組化試劑盒,、一抗二抗、細(xì)胞因子,、生物試劑、移液器,、耗材的銷售推廣及服務(wù)工作,。