大鼠堿性成纖維細胞生長因子4（bFGF-4）ELISA試劑盒說明書
本試劑盒僅供體外研究使用!
預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定大鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中堿性成纖維細胞生長因子4（bFGF-4）含量。
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗 bFGF-4抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗 bFGF-4抗體,、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物 TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的 bFGF-4呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（ OD值），計算樣品濃度,。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標準品（凍干品）： 2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為1,000 pg/ml，做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）后,，分別稀釋成1,000 pg/ml,，500 pg/ml，250 pg/ml,，125 pg/ml,，62.5 pg/ml，31.2 pg/ml,，15.6 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。如配制500 pg/ml標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ） 1,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
3. 樣品稀釋液：1×20ml,。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml,。
6. 檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100μl/孔）,，實際配制時應(yīng)多配制 0.1-0.2ml,。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。
7. 檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶,。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。
11. 覆膜：5張
12. 使用說明書：1份
自備物品
1. 酶標儀（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）
2. 微量加液器及吸頭,，EP管
3. 蒸餾水或去離子水，全新濾紙
標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3. 其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：以上標本置4℃保存應(yīng)小于1周,，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,，-20℃不應(yīng)超過1個月，-80℃不應(yīng)超過2個月,；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）,；試 劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時,，應(yīng)對樣品進行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔,、標準孔、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液,。
2. 棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加 檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制），酶標板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘,。
3. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘,。
5. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）,。
7. 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后立即進行檢測。
注：
1. 試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑,。 實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染,。
2. 加樣：加樣或加試劑時,，請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性,。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在 10分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣,。
3. 孵育：為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。
4. 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶 標儀讀數(shù),。
5. 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。請配置標準品及工作液,，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10μl），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。
6. 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘）,，如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù),。
7. 底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準確性,。
如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
洗板方法
1. 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
2. 自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的大鼠bFGF-4，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。
計算
以標準物的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標）,， OD值為橫坐標（對數(shù)坐標），在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與 OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。
檢測范圍：15.6 pg/ml - 1,000 pg/ml
zui低檢測限：7.8 pg/ml
說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。
2. 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20℃，其余試劑短期保存請置于4℃,，長期保存則置于-20℃,。
3. 濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
4. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
5. 所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
6. 有效期：6個月。
7. 本操作說明適用于48T試劑盒,，但48T試劑盒所有試劑減半,。
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