兔子E選擇素（E-Selectin）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供體外研究使用                                    

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定兔子血清、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中E選擇素（E-Selectin/CD62E）含量,。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體,，往包被抗E-Selectin/CD62E抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗E-Selectin/CD62E抗體,、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的E-Selectin/CD62E呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為50 ng/ml,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋

50 ng/ml，25 ng/ml,，12.5 ng/ml,，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml,，1.56 ng/ml,，0.78 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制25 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標本的采集及保存

1.  血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：以上標本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,，-20℃不應(yīng)超過3個月,，-80℃不應(yīng)超過6個月；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,；高血脂的標本不需進行特殊處理，可直接檢測,。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭辉噭┗驑悠废♂寱r,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時,，均應(yīng)用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前*行預(yù)實驗以建立*稀釋倍數(shù),。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔,、標準孔、待測樣品孔,?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘,。

為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘,。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃,，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。

7.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng),，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后立即進行檢測,。

注：

1.  每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔（不同于空白孔），該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2.  嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達到室 溫,。使用后立即冷藏保存試劑。

3.  洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果,。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,，避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài),。

4.  消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。

5.  在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

6.  未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，請配置標準品及工作液,，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10ul），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,；檢測液A,、B，以及底物溶液在使用前,，應(yīng)置于37℃溫育30分鐘,；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

7.  建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需

要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的兔子E選擇素（E-Selectin/CD62E）,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線（推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如curve expert 1.3），根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1.         洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

2.         一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣。

3.         請每次測定的同時做標準曲線,，做復(fù)孔,。

4.         如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5.         在配制標準品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

6.         底物請避光保存。

檢測范圍：0.78 ng/ml - 50 ng/ml

zui低檢測限：0.195 ng/ml

說明

1.          在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。

2.          小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本 / 標準品，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性,。而且,，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果,。

3.          試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃，具體以標簽上的標示為準,。

4.          濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

5.          剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

6.          中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準,。

7.          所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

8.          有效期：6個月

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