小鼠胃泌酸調(diào)節(jié)素（OXM）ELISA試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用
檢測范圍：0.78 ng/ml - 50 ng/ml
zui低檢測限：0.2 ng/ml
特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測天然或重組的小鼠OXM，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
有效期：6個(gè)月
預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定小鼠血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中OXM含量。
說明
1. 試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）,。
2. 濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。
3. 中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。
4. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。
實(shí)驗(yàn)原理
用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體，往包被抗OXM抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗OXM抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的OXM呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）： 一塊（96孔）,。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）： 2瓶（凍干品）,。
3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）： 1×20ml/瓶。
4. 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）： 1×10ml/瓶,。
5. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent） 1×10ml/瓶,。
6. 生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）： 1×120μl/瓶（1：100）。
7. 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）： 1×120μl/瓶（1：100）,。
8. 底物溶液（TMB Substrate）： 1×10ml/瓶,。
9. 濃洗滌液（Wash Buffer）： 1×20ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10. 終止液（Stop Solution）： 1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的試劑和器材
1. 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2. 高速離心機(jī)
3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱
4. 干凈的試管和Eppendof管
5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時(shí),，用多通道移液器
6. 蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存
1. 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。
標(biāo)本的稀釋原則：
首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi),，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的,。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄,。zui后計(jì)算濃度時(shí),，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”,。
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為50 ng/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋50 ng/ml,，25 ng/ml，12.5 ng/ml,，6.25 ng/ml,，3.12 ng/ml，1.56 ng/ml,，0.78 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制25 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：
臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：
臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
操作步驟
實(shí)驗(yàn)開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí),，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。
1. 加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。
2. 棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。
3. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔,，甩干,。
4. 每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃,，60分鐘,。
5. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔,，甩干,。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）,。
7. 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測,。
實(shí)驗(yàn)備注
1. 用戶在初次使用試劑盒時(shí)，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底,。
2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。
3. 為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。
4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液,、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液,、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液,。
5. 建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。
計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。
注意事項(xiàng)
1. 本操作說明適用于48T試劑盒,，但48T試劑盒所有試劑減半。
2. 當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡,。
3. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。
4. 一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。
5. 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。
6. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
7. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時(shí)，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。
8. 底物請避光保存。
9. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。
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