大鼠可溶性血管細胞粘附分子1（sVCAM-1）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用                                       

預期應用

ELISA法定量測定大鼠血清,、血漿或其它相關(guān)液體中可溶性血管細胞粘附分子1（sVCAM-1）含量,。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中sVCAM-1水平。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入sVCAM-1抗原、生物素化的抗大鼠sVCAM-1抗體,、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的sVCAM-1呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為50 ng/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋50 ng/ml,，25 ng/ml，12.5 ng/ml,，6.25 ng/ml,，3.12 ng/ml，1.56 ng/ml,，0.78 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制25 ng/ml標準品：取0.5ml 50 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標本的采集及保存

1.  細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清，并將標本保存于-20℃,，且應避免反復凍融,。

2.  血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存,，但應避免反復凍融。

3.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融,。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣：分別設空白孔,、標準孔,、待測樣品孔?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘,。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。

2.         棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘,。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃,，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1.         每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。

2.         為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標板加上蓋或覆膜,。

3.         未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

4.         建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需

要,，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的大鼠sVCAM-1，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應,。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

2. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

3. 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。

4. 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5. 在配制標準品、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制,，不能混淆。

6. 底物請避光保存,。

檢測范圍：

0.78 ng/ml - 50 ng/ml

說明

1.         試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時,，僅適用于部分試劑）；2-8℃（頻繁使用時）,。

2.         有效期：6個月

3.         濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4.         剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

5.         中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準,。

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