人高爾基蛋白73（GP-73）酶聯(lián)免疫分析

試劑盒使用說明書

廈門慧嘉生物科技有限公司

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：0.156 IU/ml - 10 IU/ml

zui低檢測限：0.039 IU/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人GP-73，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

有效期：6個月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定人血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中GP-73含量。

說明 

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。 

3．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體，往包被抗GP-73抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗GP-73抗體,、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GP-73呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。 

試劑盒組成及試劑配制 

1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）,。 

2. 標準品（Standard）：1瓶（凍干品）,。

3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。

4. 辣根過氧化物酶標記抗體稀釋液（HRP-antibody Diluent）：1×10ml/瓶,。

5. 辣根過氧化物酶標記抗體（HRP-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）

6. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶,。 

7. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。 

8. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標準規(guī)格酶標儀

2. 高速離心機

3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱

4. 干凈的試管和Eppendof管

5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時,，用多通道移液器

6. 蒸餾水,，容量瓶等

標本的采集及保存 

1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘,，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準確的,。稀釋的過程中,，應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算濃度時,，稀釋了“N”倍，標本的濃度應(yīng)再乘以“N”,。

標準品的稀釋原則：1瓶,，臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為10 IU/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋10 IU/ml,，5 IU/ml，2.5 IU/ml,，1.25 IU/ml,，0.625 IU/ml，0.312 IU/ml,，0.156 IU/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 IU/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制5 IU/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）10 IU/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

辣根過氧化物酶標記抗體的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標記抗體加990μl辣根過氧化物酶標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時,，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔,、標準孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl,，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)30分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液,。

2. 棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔,，甩干,。 

3. 每孔加辣根過氧化物酶標記抗體工作液100μl，37℃,，30分鐘,。

4. 棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔,，甩干,。

5. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）,。

6. 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。

7. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測,。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時,，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底,。

2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。 

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標準品、辣根過氧化物酶標記抗體工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品或辣根過氧化物酶標記抗體工作液,。

5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。 

注意事項

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。

3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔,。

5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

6. 在配制標準品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。