大鼠脯氨酸羥化酶（PHD）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：0.312 ng/ml - 20 ng/ml

zui低檢測限：0.1 ng/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的大鼠PHD,，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

有效期：6個月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定大鼠血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中PHD含量。

說明

1.        試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2.        濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

3.        中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。

4.        剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗PHD抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗PHD抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的PHD呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.        酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                 一塊（96孔）,。

2.        標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：                                  2瓶（凍干品）,。

3.        樣品稀釋液（Sample Diluent）：                           1×20ml/瓶。

4.        生物素標(biāo)記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：         1×10ml/瓶,。

5.        辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（HRP-avidin Diluent）   1×10ml/瓶,。

6.        生物素標(biāo)記抗體（Biotin-antibody）：             1×120μl/瓶（1：100）。

7.        辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（HRP-avidin）：      1×120μl/瓶（1：100）,。

8.        底物溶液（TMB Substrate）：                            1×10ml/瓶,。

9.        濃洗滌液（Wash Buffer）：  1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.    終止液（Stop Solution）：                    1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1.        標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.        高速離心機

3.        電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.        干凈的試管和Eppendof管

5.        系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時,，用多通道移液器

6.    蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存

1.        血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.        血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.        細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測,。

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù),。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi),，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中,，應(yīng)做好詳細的記錄,。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍,，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”,。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為20 ng/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋20 ng/ml,，10 ng/ml，5 ng/ml,，2.5 ng/ml,，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml,，0.312 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制10 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）20 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過高時,，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

1.        加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100μl,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2.        棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。

3.        溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔,，甩干,。

4.        每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃,，60分鐘,。

5.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，200μl/每孔,，甩干。

6.        依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）,。

7.        依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.        用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測,。

實驗備注

1.        用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底,。

2.      每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

3.        為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4.        未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液,、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液,、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液,。

5.        建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1.        本操作說明適用于48T試劑盒,，但48T試劑盒所有試劑減半。

2.        當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡,。

3.        洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。

4.        一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

5.        請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。

6.        如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

7.        在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

8.        底物請避光保存。

9.        不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。

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