人神經(jīng)節(jié)苷脂抗體IgG（GM1）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

zui低檢測限：1 ng/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測人GM1 （IgG），且與其他相關抗體無交叉反應,。

有效期：6個月

預期應用：ELISA法半定量測定人血清,、血漿或其它相關生物液體中GM1 （IgG）含量,。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

3．中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結果造成任何影響。

實驗原理

用GM1抗原包被酶標板,，制成固相載體,。向微孔中先加入待測樣品進行反應，然后再加入辣根過氧化物酶標記抗人IgG進行反應,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的GM1 （IgG）呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品中抗體的效價（抗血清zui終能顯色的zui高稀釋倍數(shù)記為效價）,。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）,。

2.         樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。

3.         辣根過氧化物酶標記抗人IgG稀釋液 （HRP-anti-human IgG Diluent）：1×10ml/瓶,。

4.         辣根過氧化物酶標記抗人IgG（HRP-anti-human IgG）：1×120μl/瓶（1：100）,。

5.         底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

6.         濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

7.         終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1.         標準規(guī)格酶標儀

2.         高速離心機

3.         電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.         干凈的試管和Eppendof管

5.         系列可調節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時,，用多通道移液器

6.    蒸餾水,，容量瓶等

標本的采集及保存

1.         血清：全血標本請于室溫放置2小時或室溫過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。

2.         血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。

3.         細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。稀釋的過程中,，應做好詳細的記錄,。zui后計算抗體效價時，稀釋了“N”倍,，標本中抗體的效價為“N”,。

辣根過氧化物酶標記抗人IgG的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標記抗人IgG稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標記抗人IgG加990μl辣根過氧化物酶標記抗人IgG稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內配制。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

1.         加樣：分別設空白孔、待測樣品孔,?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100μl,，余孔加待測樣品100μl，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘。

2.         棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加辣根過氧化物酶標記抗人IgG工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內配制），37℃,，60分鐘,。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔,，甩干。

4.         依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內,，此時肉眼可見孔內有明顯藍色，即可終止）,。

5.         依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結果的準確性,，底物反應時間到后應盡快加入終止液。

6.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測,。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底,。

2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4,。測量時先用此孔調OD值至零,。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內,，酶標板加上蓋或覆膜,。

4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存,。辣根過氧化物酶標記抗人IgG工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復使用已稀釋過的辣根過氧化物酶標記抗人IgG工作液。

5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

計算

為檢測樣品中GM1 （IgG）效價，客戶可以采取樣品2倍倍比稀釋樣品計算抗體效價,，一般采取以1:40為起始稀釋倍數(shù)（使用樣品稀釋液進行稀釋）,。zui大稀釋倍數(shù)根據(jù)客戶自身試驗要求而定，zui終顯色與陰性對照孔進行比較,，有明顯差異的zui大稀釋度定為抗體的zui終效價,。

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡,。

2. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間控制在5分鐘內,，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

4. 如標本中待測物質含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5. 在配制檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制，不能混淆,。

6. 底物請避光保存,。

7. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。

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