大鼠羥脯氨酸（Hyp）酶聯(lián)免疫分析

試劑盒使用說明書

廈門慧嘉生物科技有限公司

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：156 ng/ml -10000 ng/ml

zui低檢測限：39 ng/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的大鼠Hyp,，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

有效期：6個月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定大鼠血清、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中Hyp含量,。

說明 

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 

3．中,、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

概述

羥脯氨酸（hydroxyproline）,，是亞氨基酸之一，通常在第四位上帶有羥基,，但有時也在第3位上,。由于有兩個不對稱的碳原子，所以有4種立體異構(gòu)體,。自然界中不存在D-羥脯酸,。在動物膠和骨膠原中含有L-羥脯氨酸,。L-別羥脯氨酸是從鬼筆鵝膏（Amanita Phalloides）中得到的有毒的多肽鬼筆環(huán)肽（phalloidine）的組成成分,。一般的蛋白質(zhì)不存在這種氨基酸,。在自然界的羥脯氨酸的甲基衍生物中有左旋水蘇堿、右旋水蘇堿和γ-羥古液酸,。在生物體內(nèi)羥脯氨酸是由脯氨酸合成的,，但不是以游離狀態(tài)，而是在肽鏈中被羥基化,。它的分解作用類似脯氨酸,，但以帶著羥基的狀態(tài)進行，所以成為4-羥基谷氨酸,。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體，往包被抗Hyp抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗Hyp抗體,、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Hyp呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。 

試劑盒組成及試劑配制 

1. 酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）,。 

2. 標準品（Standard）：2瓶（凍干品）,。

3. 樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。

4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶,。

5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶,。

6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）

7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）

8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 

9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。 

10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

需要而未提供的試劑和器材

1. 標準規(guī)格酶標儀

2. 高速離心機

3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱

4. 干凈的試管和Eppendof管

5. 系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時,，用多通道移液器

6. 蒸餾水，容量瓶等

標本的采集及保存 

1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融,。

2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融,。

3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復凍融,。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標準曲線的范圍內(nèi),，檢測的結(jié)果才是準確的,。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄,。zui后計算濃度時,，稀釋了“N”倍，標本的濃度應(yīng)再乘以“N”,。

標準品的稀釋原則：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為10000 ng/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋10000 ng/ml,，5000 ng/ml，2500 ng/ml,，1250 ng/ml,，625 ng/ml，312 ng/ml,，156 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制5000 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）10000 ng/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

生物素標記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線,。如樣品濃度過高時,，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔,、標準孔、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘,。

為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2. 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。

3. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔，甩干,。 

4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl,，37℃，60分鐘,。

5. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔,，甩干,。

6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色,，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）,。

7. 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測,。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到管底,。

2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。 

3. 為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標準品,、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復使用已稀釋過的標準品,、生物素標記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標記親和素工作液,。

5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。 

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡,。

2. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔,。

5. 如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

6. 在配制標準品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。