人血管內皮細胞生長因子D（VEGF-D）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

檢測范圍：78 pg/ml - 5000 pg/ml

zui低檢測限：19.5 pg/ml

特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人VEGF-D，且與其他相關蛋白無交叉反應,。

有效期：6個月

預期應用：ELISA法定量測定人血清,、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中VEGF-D含量,。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

3．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準,。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質,，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結果造成任何影響,。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗VEGF-D抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗VEGF-D抗體、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的VEGF-D呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96孔）,。

2.         標準品（Standard）：2瓶（凍干品）。

3.         樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶,。

4.         生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶,。

5.         辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。

6.         生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100）

7.         辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100）

8.         底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

需要而未提供的試劑和器材

1.         標準規(guī)格酶標儀

2.         高速離心機

3.         電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.         干凈的試管和Eppendof管

5.         系列可調節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.    蒸餾水,，容量瓶等

標本的采集及保存

1.         血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。

2.         血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8°C 1000 g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。

3.         細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

標本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當?shù)南♂尡稊?shù),。只有稀釋至標準曲線的范圍內,，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中,，應做好詳細的記錄,。zui后計算濃度時，稀釋了“N”倍,，標本的濃度應再乘以“N”,。

標準品的稀釋原則：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為5000 pg/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋5000 pg/ml,，2500 pg/ml,，1250 pg/ml，625 pg/ml,，312 pg/ml,，156 pg/ml，78 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml,，臨用前15分鐘內配制。

如配制2500 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）5000 pg/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。

生物素標記抗體的稀釋原則：

臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標記抗體加990μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內配制,。

辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100μl）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如10μl辣根過氧化物酶標記親和素加990μl辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內配制,。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線,。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

1.         加樣：分別設空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,，余孔分別加標準品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘,。

為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。

2.         棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加生物素標記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標記抗體加99μl生物素標記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內配制）,，37℃,60分鐘,。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，200μl/每孔,，甩干,。

4.         每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100μl，37℃,，60分鐘,。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，200μl/每孔,，甩干。

6.         依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色（30分鐘內,，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯,，即可終止）,。

7.         依序每孔加終止溶液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測,。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時,，應將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底,。

2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4,。測量時先用此孔調OD值至零,。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內,，酶標板加上蓋或覆膜,。

4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品,、生物素標記抗體工作液,、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品,、生物素標記抗體工作液,、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。

5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘,。根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

計算

以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩,，避免起泡,。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。

3. 一次加樣時間控制在5分鐘內,，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

4. 請每次測定的同時做標準曲線,，做復孔。

5. 如標本中待測物質含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

6. 在配制標準品、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制,，不能混淆。

7. 底物請避光保存,。

8. 不要用其它生產廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。

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