使用說明書

                       廈門慧嘉生物科技有限公司

本試劑盒僅供體外研究使用,、不用于臨床診斷!

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定大鼠血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中分泌型磷脂酶A2（sPLA2）含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的sPLA2抗體包被微孔板，制成固相載體,，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的sPLA2抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的sPLA2呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（值）,，計(jì)算樣品濃度。 

試劑盒組成及試劑配制 

1,、 酶標(biāo)板：一塊（96孔） 

2,、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制,。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為400 pg/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋）,，分別配制成400 pg/ml,，200 pg/ml，100 pg/ml,，50 pg/ml,，25 pg/ml，12.5 pg/ml,，6.25 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 pg/ml。如配制200 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）400 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。

3,、 樣品稀釋液：1×20ml,。

4、 檢測稀釋液A：1×10ml,。

5,、 檢測稀釋液B：1×10ml。

6,、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990檢測稀釋液A），充分混勻,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100/孔）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制  0.1-0.2ml,。

7,、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）,。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。

8、 底物溶液：1×10ml/瓶,。

9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。 

10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）,。

11,、覆膜：5張

12、使用說明書：1份

自備物品 

1,、 酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）

2,、 微量加液器及吸頭，EP管

3,、 蒸餾水或去離子水,，濾紙 

標(biāo)本的采集及保存 

1、 血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時(shí)或4過一晚后于1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20或-80保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2,、 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于 1000g離心15分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)⑸锨?/span>置于-20或-80保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3、 其它生物標(biāo)本：請1000g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?/span>-20或-80保    存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存，4保存應(yīng)小于1周,，-20不應(yīng)超過1個(gè)月,，-80不應(yīng)超過2個(gè)月,；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫,，試劑不能直接在37溶解；試劑或樣品配制時(shí),，均需充分混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡,。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測樣品含量,，如樣品濃度過高時(shí),，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。

1,、 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液 100 ,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100,，注意不要有氣泡，加樣 時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37溫育2小時(shí),。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效

性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2,、 棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100（臨用前配制），酶標(biāo)板加上覆膜,，37溫育1小時(shí),。

3,、 棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘，大約400/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。 

4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100,，加上覆膜,，37溫育1小時(shí)。

5,、 棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，方法同步驟3,。

6、 每孔加底物溶液90,，酶標(biāo)板加上覆膜37避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在15-30分鐘,，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí),，即可終止）,。

7、 每孔加終止溶液50,，終止反應(yīng),，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物    液的加入順序相同,。

8,、 立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（值）。

注：

1,、 試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實(shí)驗(yàn)操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染,。

2、 加樣：加樣或加試劑時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大,，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi),。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。

3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā),，實(shí)驗(yàn)時(shí)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度,。

4,、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5,、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理,，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。請 配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時(shí),，一次不要小于10）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀  釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液。

6,、 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘），如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7,、 底物：底物請避光保存,，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

洗板方法

1,、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。

2,、 自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的大鼠sPLA2,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  各標(biāo)準(zhǔn)品 值扣除空白孔 值后作圖（七點(diǎn)圖）,，如設(shè)置復(fù)孔,，則應(yīng)取其平均值計(jì)算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,，如 curve expert 1.3,，根據(jù)樣品值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。 

檢測范圍：6.25 pg/ml - 400 pg/ml,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請取用以下濃度值：400 pg/ml，200 pg/ml,，100 pg/ml,，50 pg/ml，25 pg/ml,，12.5 pg/ml,，6.25 pg/ml。

zui低檢測限：1.65 pg/ml

說明 

1,、 只有全部使用試劑才能保證檢測效果,，因?yàn)樗性噭┒际怯嘘P(guān)聯(lián)的，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守試劑的實(shí)驗(yàn)說明才會(huì)得到*的檢測結(jié)果,。如由于實(shí)驗(yàn)者的操作失誤或試劑盒保存不當(dāng)導(dǎo)致結(jié)果不佳,，不屬產(chǎn)品質(zhì)量問題。

2,、 在儲(chǔ)存及溫育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的   污染，因?yàn)榈鞍姿饷傅母蓴_將導(dǎo)致出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果,。

3,、 試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20,，其余試劑短期保存請置于4，長期保存則置于-20,。開封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于-20,，避免潮濕。

4,、 濃洗滌液會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

5,、 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。

6、 有效期：6個(gè)月,。

7,、 本操作說明適用于48T試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半,。