試劑盒使用說明書

廈門慧嘉生物科技有限公司

本試劑盒僅供研究使用

預期應用

ELISA法定量測定大鼠血清,、血漿或其它相關液體中膽囊收縮素,，CCK含量,。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中CCK水平,。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被抗體的微孔中依次加入CCK,、生物素化的抗大鼠CCK抗體、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的CCK呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。 

試劑盒組成 

1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 

標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為100 pmol/L，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成100 pmol/L,，50 pmol/L ，25 pmol/L,，12.5 pmol/L,，6.25 pmol/L，3.12 pmol/L,，1.56 pmol/L,，其原液直接作為zui高標準濃度，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pmol/L,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制50 pmol/L標準品：取0.5ml 100 pmol/L的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的離心管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

2. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

3. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。

4. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。

5. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋。

6. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。

7. 底物溶液：1×10ml/瓶,。 

8. 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 

9. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）,。 

標本的采集及保存 

1．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存,，但應避免反復凍融,。

2．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融。

注：標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?/span>試劑或樣品稀釋時,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線,。如樣品濃度過高時,，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

1. 加樣：分別設空白孔,、標準孔、待測樣品孔,?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘,。

為保證實驗結果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2. 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘。

3. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干,。 

4. 每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃,，60分鐘,。

5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干。

6. 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。

7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。

8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。 

2．為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜。

3.  未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

4.  建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層

吸水紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次,。
    自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的大鼠CCK,，且與其它相關蛋白無交叉反應,。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。 

注意事項

1． 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2． 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

3． 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔,。

4． 如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標準品,、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制，不能混淆,。

6．底物請避光保存,。

檢測范圍：

15.6 pg/ml-1000 pg/ml

靈敏度：

3.9 pg/ml

說明 

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結果造成任何影響,。 

5．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準,。