廈門慧嘉生物科技有限公司

本試劑盒僅供研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定小鼠血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中IL-23含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中IL-23水平。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入IL-23抗原、生物素化的抗小鼠IL-23抗體,、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的IL-23呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度,。 

試劑盒組成及試劑配制 

1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔） 

2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成10000 pg/mL,，5000 pg/mL ，2500 pg/mL,，1250 pg/mL,，625 pg/mL，312.5 pg/mL,，156 pg/mL,，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制5000 pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10000 pg/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。

5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。

6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul）,，實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。

7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。

8. 底物溶液：1×10ml/瓶,。 

9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 

10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 

標(biāo)本的采集及保存 

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃,，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫,。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，輕輕混勻，酶標(biāo)板加上蓋,，37℃反應(yīng)120分鐘,。

2. 棄去液體，甩干,，不用洗滌,。

3. 每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘,。洗板3次,，350ul/每孔，甩干,。 

4. 每孔加檢測溶液B工作液 100ul,，37℃，60分鐘,，洗板5次,，甩干。

5. 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯）,。

6. 依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。 

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠IL-23,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。 

注意事項(xiàng)

1． 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2． 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

3． 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。

4． 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計(jì)算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：1.56 pg/ml-100 pg/ml

靈敏度：0.39 pg/ml

（發(fā)表有三篇外文文獻(xiàn)）

說明 

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。 

5．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。