豬白細(xì)胞介素-8（IL-8）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究研究使用                                    

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定豬血清,、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清,、肺泡盥洗液等其它相關(guān)液體中IL-8含量,。

概述

白細(xì)胞介素（IL-8）是1987年首先在受脂多糖刺激的豬單核細(xì)胞培養(yǎng)液上清中分離提純的一種堿基肝素結(jié)合蛋白，具有內(nèi)源性白細(xì)胞趨化和活化作用,，zui初命名為單核細(xì)胞源性中性細(xì)胞趨化因子（monocyte-drvived neutrophils chemotactic factor, MDNCF）,，1998年被正式統(tǒng)一命名為中性粒細(xì)胞活化肽/IL-8（NAP/IL-8）。IL-8屬于CXC型亞家族,，又因其氨基酸*個半胱氨酸前有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸而稱為ELR⁺-CXC型趨化因子,。IL-8是一種可由多細(xì)胞來源的多功能趨化因子,，其生物學(xué)功能無種屬特異性,，除具有特異性使中性粒細(xì)胞離開血流游走到炎癥組織,，脫顆粒，產(chǎn)生超氧陰離子,，引起呼吸爆發(fā)外,，還顯示出促血管生成的活性,，可參與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及血管生成,。此外,，IL-8對淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞也有趨化和活化作用。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中IL-8水平,。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入IL-8抗原、生物素化的抗豬IL-8抗體,、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的IL-8呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。

試劑盒組成

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，充分混和后其濃度為1000pg/mL,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成500 pg/mL，250 pg/mL ,，125 pg/mL,，62.5pg/mL，31.2pg/mL,，15.6 pg/mL,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A1：100稀釋,。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標(biāo)本的采集及保存

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時后于1000 x g離心30分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3．血漿：標(biāo)本可采用肝素、EDTA或枸櫞酸鹽做為抗凝劑,。標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)1000 x g離心15分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔。除空白孔外,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul,，輕輕混勻，37℃,，120分鐘,。

2.         棄去液體，甩干,，不用洗滌,。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘,。洗板3次,，350ul/每孔，甩干,。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul,，37℃，60分鐘,，洗板5次,，甩干。

5.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘,。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層

吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
    自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

本試劑盒可同時檢測重組或天然的豬IL-8,。

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。

靈敏度

本試劑盒測定豬IL-8的zui小可檢測檢測濃度（MDD）,，其值一般約為0.28 pg/mL

注意事項

1．  洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

3．  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。

4．  如標(biāo)本中IL-8含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。

檢測范圍：

15.6 pg/mL – 1000 pg/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

4．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。

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