Rat P-Selectin ELISA Kit
 
 
Catalog No. CSB-E07399r
（96 T）
 
 
 
 
 
  This  immunoassay  kit  allows  for  the  in  vitro  quantitative  determination  of  rat
P-Selectin concentrations in serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
PRINCIPLE OF THE ASSAY 
The microtiter plate provided in this kit has been pre-coated with
an  antibody  specific  to  P-Selectin.  Standards  or  samples  are
then  added  to  the  appropriate  microtiter  plate  wells  with  a
biotin-conjugated  antibody  preparation  specific  for  P-Selectin
and  Avidin  conjugated  to  Horseradish  Peroxidase  （HRP）  is
added  to  each  microplate  well  and  incubated.  Then  a  TMB
（3,3',5,5'  tetramethyl-benzidine）  substrate  solution  is  added  to
each  well.  Only  those  wells  that  contain  P-Selectin,
biotin-conjugated  antibody  and  enzyme-conjugated  Avidin  will
exhibit  a  change  in  color.  The  enzyme-substrate  reaction  is
terminated by  the addition  of  a  sulphuric  acid  solution  and  the
color  change  is  measured  spectrophotometrically  at  a
wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of P-Selectin in
the  samples  is  then  determined  by  comparing  the O.D.  of  the
samples to the standard curve.
DETECTION RANGE
1.56 ng/ml-100 ng/ml. The standard curve concentrations used
for the ELISA’s were 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml,
6.25 ng/ml, 3.12 ng/ml, 1.56 ng/ml.
SPECIFICITY 
This  assay  recognizes  recombinant  and  natural  rat P-Selectin.
No significant cross-reactivity or interference was observed.
SENSITIVITY
The minimum detectable dose of  rat P-Selectin  is  typically  less
than 0.39 ng/ml.
The sensitivity of  this assay, or Lower Limit of Detection  （LLD）
was  defined  as  the  lowest  protein  concentration  that  could  be
differentiated from zero.
MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1
Standard  2
Sample Diluent      1 x 20 ml
Biotin-antibody Diluent      1 x 10 ml
HRP-avidin Diluent        1 x 10 ml
Biotin-antibody      1 x 120µl
HRP-avidin  1 x 120µl
Wash Buffer      
1 x 20 ml
  （25×concentrate）
TMB Substrate      1 x 10 ml
Stop Solution      1 x 10 ml
STORAGE 
1. Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt
and  the microtiter plate should be kept  in a sealed bag. The
test kit may be used throughout the expiration date of the kit,
provided  it  is  stored  as  prescribed  above.  Refer  to  the
package label for the expiration date.
2. Opened test plate should be stored at 2-8°C in the aluminum
foil bag with desiccants to minimize exposure to damp air. The
kits will remain stable until the expiring date shown, provided it
is stored as prescribed above.    
3.  A microtiter  plate  reader with  a  bandwidth  of  10  nm  or  less
and an optical density  range of 0-3 OD or greater at 450nm
wavelength  is  acceptable  for  use  in  absorbance
measurement.
REAGENT PREPARATION
Bring all reagents to room temperature before use.  
1.  Wash  Buffer    If  crystals  have  formed  in  the  concentrate,
warm  up  to  room  temperature  and  mix  gently  until  the
crystals  have  compley  dissolved.  Dilute  20  ml  of Wash
Buffer Concentrate into deionized or distilled water to prepare
500 ml of Wash Buffer.
2.  Standard    Centrifuge  the  standard  vial  at  6000-10000rpm 
for  30s.  Reconstitute  the  Standard  with  1.0 ml  of  Sample
Diluent. This reconstitution produces a stock solution of 100
ng/ml. Allow the standard to sit for a minimum of 15 minutes
with  gentle  agitation  prior  to  making  serial  dilutions.  The
undiluted standard serves as  the high standard （100 ng/ml）.
The Sample Diluent serves as  the zero standard （0 ng/ml）.
Prepare fresh for each assay. Use within 4 hours and discard
after use.
3.  Biotin-antibody    Centrifuge  the vial before opening. Dilute
to  the  working  concentration  using  Biotin-antibody
Diluent（1:100）, respectively.
4.  HRP-avidin    Centrifuge the vial before opening. Dilute to the
working  concentration  using  HRP-avidin  Diluent（1:100）,
respectively.
Precaution: The Stop Solution provided with  this kit  is an acid solution. Wear
eye, hand, face, and clothing protection when using this material.
OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader capable of measuring absorbance at 450
nm, with the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm. 
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt  bottle,  manifold  dispenser,  or  automated  microplate
washer.
  An incubator which can provide stable incubation conditions
up to 37°C±0.5°C.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Serum    Use  a  serum  separator  tube  （SST）  and  allow
samples  to  clot  for  30 minutes  before  centrifugation  for  15
minutes at 1000 g. Remove serum and assay immediay or
aliquot  and  store  samples  at  -20°C. Centrifuge  the  sample
again  after  thawing  before  the  assay.  Avoid  repeated
freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as
an anticoagulant. Centrifuge for 15 minutes at 1000 g within
30 minutes  of  collection.  Assay  immediay  or  aliquot  and
store  samples  at  -20°C.  Centrifuge  the  sample  again   after
thawing before the assay. Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay. 
ASSAY PROCEDURE
Bring  all  reagents  and  samples  to  room  temperature  before  use.  It  is
recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.
All  the  reagents  should  be  added  directly  to  the  liquid  level  in  the well.  The
pipette should avoid contacting the inner wall of the well.
1.  Recommend  to  dilute  the  serum  or  plasma  samples  with
Sample Diluent（1:200）  before  test.  The  suggested  200-fold
dilution can be achieved by adding 10µl sample  to 190µl of
Sample  Diluent.  Complete  the  200-fold  dilution  by  adding
25µl of this solution to 225µl of Sample Diluent.
2.  Add 100µl of Standard, Blank, or Sample per well. Cover with
the adhesive strip. Incubate for 2 hours at 37°C.  
3.  Remove the liquid of each well, don’t wash.  
4.  Add 100µl of Biotin-antibody working solution to each well.
Incubate  for  1  hour  at  37°C.  Biotin-antibody  working
solution may appear cloudy. Warm up  to  room  temperature
and mix gently until solution appears uniform.
5.  Aspirate  each  well  and  wash,  repeating  the  process  three
times  for a  total of  three washes. Wash: Fill each well with 
Wash  Buffer  （200µl）  and  let  it  stand  for  2  minutes,  then
remove  the  liquid  by  flicking  the  plate  over  a  sink.  The
remaining drops are removed by patting the plate on a paper
towel. Complete removal of liquid at each step is essential to
good performance.
6.  Add  100µl  of  HRP-avidin  working  solution  to  each  well.
Cover the microtiter plate with a new adhesive strip. Incubate
for 1 hour at 37°C.
7.  Repeat the aspiration and wash five times as step 4.
8.  Add 90µl of TMB Substrate to each well. Incubate for 10-30
minutes  at  37°C.  Keeping  the  plate  away  from  drafts   and
other temperature fluctuations in the dark.  
9.  Add 50µl of Stop Solution  to each well when  the  first  four
wells  containing  the  highest  concentration  of  standards
develop obvious blue color.  If color change does not appear
uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
10. Determine the optical density of each well within 30 minutes,
using a microplate reader set to 450 nm.
CALCULATION OF RESULTS 
Using  the  professional  soft  "Curve  Exert  1.3"  to  make  a  standard  curve  is
recommended, which can be downloaded from our web.
Average  the duplicate  readings  for each standard, control, and
sample and subtract  the average zero standard optical density.
Create  a  standard  curve  by  reducing  the  data  using  computer
software capable of generating a  four parameter  logistic  （4-PL）
curve-fit. As an alternative, construct a standard curve by plotting
the mean  absorbance  for  each  standard  on  the  y-axis  against
the concentration on the x-axis and draw a best fit curve through
the points on  the graph. The data may be  linearized by plotting
the log of the P-Selectin concentrations versus the log of the O.D.
and  the best  fit  line can be determined by  regression analysis.
This procedure will produce an adequate but  less precise  fit of
the data.  If samples have been diluted,  the  concentration  read
from the standard curve must be multiplied by the dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the
kit label.
  Do not mix or substitute reagents with those from other lots or
sources. 
  It  is  important  that  the  Standard  Diluent  selected  for  the
standard  curve  be  consistent  with  the  samples  being
assayed.
  If samples generate values higher than the highest standard,
dilute the samples with the appropriate Standard Diluent and
repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipetting
technique,  washing  technique,  incubation  time  or
temperature, and kit age can cause variation in binding.
  This  assay  is  designed  to  eliminate  interference  by  soluble
receptors,  binding  proteins,  and  other  factors  present  in
biological samples. Until all  factors have been  tested  in  the
Immunoassay,  the  possibility  of  interference  cannot  be
excluded.
TECHNICAL HINTS
  Centrifuge vials before opening to collect contents.
  When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid
foaming.
  To  avoid  cross-contamination,  change  pipette  tips  between
additions of each standard  level, between sample additions, 
and between reagent additions. Also, use separate reservoirs
for each reagent.
  When using an automated plate washer, adding a 30 second
soak  period  following  the  addition  of  wash  buffer,  and/or
rotating  the  plate  180  degrees  between  wash  steps  may
improve assay precision.
  To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers
during incubation steps is necessary.
  Substrate Solution should remain colorless or light blue until
added  to  the plate. Keep Substrate Solution protected  from
light. Substrate Solution should change from colorless or light
blue to gradations of blue.
  Stop Solution should be added to the plate in the same order
as  the Substrate Solution. The color developed  in  the wells
will turn from blue to yellow upon addition of the Stop Solution.
Wells  that are green  in color  indicate  that  the Stop Solution
has not mixed thoroughly with the Substrate Solution.
 
 
 
大鼠 大鼠 大鼠 大鼠 P 選擇素 選擇素 選擇素 選擇素（P-Selectin/CD62P）酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析 酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說(shuō)明書(shū) 試劑盒使用說(shuō)明書(shū) 試劑盒使用說(shuō)明書(shū) 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào)： ：： ：CSB-E07399r
檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍： ：： ：1.56 ng/ml - 100 ng/ml
zui低檢測(cè)限 zui低檢測(cè)限 zui低檢測(cè)限 zui低檢測(cè)限： ：： ：0.39 ng/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的大鼠 P-Selectin，且與其他相
關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng),。
有效期 有效期 有效期 有效期： ：： ：6 個(gè)月
預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用： ：： ：ELISA 法定量測(cè)定大鼠血清,、血漿或其它相關(guān)生物液體中
P-Selectin 含量,。
說(shuō)明 說(shuō)明 說(shuō)明 說(shuō)明  
11. 試劑盒保存：未開(kāi)封的試劑盒應(yīng)儲(chǔ)存于 2-8℃；開(kāi)封后的酶標(biāo)板應(yīng)與干燥
劑一起儲(chǔ)存于鋁箔袋中置于 2-8℃保存,。僅在此出儲(chǔ)存條件下,，產(chǎn)品在有
效期內(nèi)可正常使用。
12. 濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。  
13. 中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處,，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn),。
14. 剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會(huì)對(duì)實(shí)
驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。 
實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理
用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體,，往包被抗 P-Selectin 抗體的
微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗 P-Selectin 抗體,、HRP標(biāo)記的
親和素,，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物 TMB 顯色。TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)
化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的
P-Selectin 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）,，計(jì)算
樣品濃度,。  
試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板 酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                                              一塊 （96孔）。   
2.  標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 （Standard）：                                                                   2 瓶（凍干品）,。 
3.  樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液 樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                                     1×20ml/瓶,。 
4.  生物素標(biāo)記抗體稀釋液 生物素標(biāo)記抗體稀釋液 生物素標(biāo)記抗體稀釋液 生物素標(biāo)記抗體稀釋液（ （（ （Biotin-antibody Diluent） ）） ）：               1×10ml/瓶。 
5.  辣根過(guò)氧 辣根過(guò)氧 辣根過(guò)氧 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （ （（ （HRP-avidin Diluent） ）） ）     1×10ml/瓶,。 
6.  生物素標(biāo)記抗體 生物素標(biāo)記抗體 生物素標(biāo)記抗體 生物素標(biāo)記抗體 （ （（ （Biotin-antibody） ）） ）：                           1×120µl/瓶（1： 100）,。 
7.  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 （ （（ （HRP-avidin） ）） ）：             1×120µl/瓶（1： 100）。 
8.  底物溶液 底物溶液 底物溶液 底物溶液 （ （（ （TMB Substrate） ）） ）：                                                       1×10ml/瓶,。   
9.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）  1×20ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍,。   
10. 終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                            1×10ml/瓶。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.  高速離心機(jī)
3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.  干凈的試管和 Eppendof 管
5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測(cè)樣品較多時(shí),，用多通道移液器 
6.  蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存  
1.  血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g離心20分鐘,，
取上清即可立即檢測(cè),；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但
應(yīng)避免反復(fù)凍融,。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后檢測(cè),。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)于 2  -  8°C
1000 g離心 15 分鐘，取上清即可立即檢測(cè),；或進(jìn)行分裝,，并將標(biāo)本放于
-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。解凍后的樣品應(yīng)再次離心,，然后
檢測(cè)。
3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心 20 分鐘,，取上清即可立即
檢測(cè),；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
解凍后的樣品應(yīng)再次離心,，然后檢測(cè),。
注 注注 注： ：： ：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果， ,，,， ，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。 ,。。 ,。
標(biāo)本的稀釋原則 標(biāo)本的稀釋原則 標(biāo)本的稀釋原則 標(biāo)本的稀釋原則： ：： ：
首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi),，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的,。稀釋的過(guò)程中,，應(yīng)
做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí),，稀釋了“N”倍,，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。 
標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則： ：： ：2 瓶,，使用前于 6000-10000rpm 離心 30 秒,。 每
瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好后靜置 10 分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒
/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為 100 ng/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋 100 ng/ml,
50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.25 ng/ml, 3.12 ng/ml, 1.56 ng/ml,，樣品稀
釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度 0  ng/ml，臨用前 15 分鐘內(nèi)配制,，用完丟棄,，下次檢
測(cè)使用新鮮配置的標(biāo)準(zhǔn)品。
如配制 50 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取 0.5ml（不要少于 0.5ml）100 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)
品加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendorf 管中,，混勻即可,，其余濃度以此類(lèi)
推。
生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則 生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則 生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則 生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則： ：： ：
打開(kāi)瓶蓋前請(qǐng)離心,，收集瓶壁上的溶液,。臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀
釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔 100µl），實(shí)際
配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml,。如 10µl生物素標(biāo)記抗體加 990µl生物素標(biāo)記抗體
稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則： ：： ：
打開(kāi)瓶蓋前請(qǐng)離心,，收集瓶壁上的溶液。臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和
素稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔
100µl）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制 0.1-0.2ml,。如10µl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素
加 990µl 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻,，在使用
前一小時(shí)內(nèi)配制,。
操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí),，均需混勻，混勻
時(shí)盡量避免起泡,。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過(guò)高時(shí),，用樣品
稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)允箻悠贩显噭┖械臋z測(cè)范圍。加樣時(shí),，槍頭應(yīng)直接對(duì)
準(zhǔn)液面,，切勿沿孔壁加樣。
4.  血清,，血漿樣本用樣本稀釋液進(jìn)行 1:200 倍稀釋后進(jìn)行檢測(cè),，具體操作如
下：取 10µl 樣本加入到 190µl 的樣本稀釋液（1:20 稀釋?zhuān)┲谢靹颍?br />從上述稀釋液中取 25µl加入到 225µl 樣本稀釋液（1:10 稀釋?zhuān)┲谢靹颉?
得到的即為 1:200 倍稀釋后的樣本,。
5.  加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?100µl，
余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100µl,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于
酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，
37℃反應(yīng) 120 分鐘,。
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
6.  棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液  100µl （取 1µl
生物素標(biāo)記抗體加 99µl 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻,，
在使用前一小時(shí)內(nèi)配制），37 ,60 ℃ 分鐘,。
7.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板 3 次，每次浸泡 1-2分鐘,，
200µl/每孔,，甩干。  
8.  每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液）
100µl,，37℃,，60 分鐘,。
9.  溫育 60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板 5 次，每次浸泡 1-2分鐘,，
200µl/每孔,，甩干。
10. 依序每孔加底物溶液 90µl,，37℃避光顯色（ （（ （30 分鐘內(nèi),，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)
準(zhǔn)品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色，后 3-4 孔顯色不明顯,，即可終止）,。
11. 依序每孔加終止溶液 50µl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加
入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底
物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
12. 用酶聯(lián)儀在 450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD 值）,。 在加終止液
后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)備注 實(shí)驗(yàn)備注 實(shí)驗(yàn)備注 實(shí)驗(yàn)備注 
1.  用戶在初次使用試劑盒時(shí),，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到
管底。
2.  每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶
液及終止液。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào) OD值至零,。  
3.  為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上
蓋或覆膜,。
4.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請(qǐng)于 2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體
工作液,、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)
勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液,、或辣根過(guò)氧化物
酶標(biāo)記親和素工作液。
5.  建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定,，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
洗板方法 洗板方法 洗板方法 洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上
鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml
注入孔內(nèi),，浸泡 1-2 分鐘。根據(jù)需要,，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次,。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,。
計(jì)算 計(jì)算 計(jì)算 計(jì)算
請(qǐng)從我們的下載專(zhuān)業(yè)軟件"Curve Exert 1.3",，并根據(jù)提示制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對(duì)
數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的 OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；
再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方
程式，將樣品的 OD 值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即
為樣品的實(shí)際濃度,。
注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng)
1.  本操作說(shuō)明適用于 本操作說(shuō)明適用于 本操作說(shuō)明適用于 本操作說(shuō)明適用于 48T 試劑盒 試劑盒 試劑盒 試劑盒,， ，,， ,，  48T 試劑盒中酶聯(lián)板 試劑盒中酶聯(lián)板 試劑盒中酶聯(lián)板 試劑盒中酶聯(lián)板、 ,、,、 、標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品,、 ,、、 ,、生物素 生物素 生物素 生物素
標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半 標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半 標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半 標(biāo)記抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素減半,。 。,。 ,。
2.  當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡,。
3.  洗滌過(guò)程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。
4.  一次加樣時(shí)間控制在 5 分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。 
5.  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。
6.  如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋
倍數(shù),。
7.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí),，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。 
8.  底物請(qǐng)避光保存,。
9.  不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。