豬血管生成素1（ANG-1）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用                                       

預期應用

ELISA法定量測定豬血清、血漿或其它相關液體中ANG-1含量,。

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中ANG-1水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入ANG-1,、生物素化的抗ANG-1抗體,、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ANG-1呈正相關,。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為100 ng/mL,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成200 ng/mL,，100 ng/mL,，50 ng/mL，25 ng/mL,，12.5 ng/mL ,，6.2 ng/mL，3.1 ng/mL ,，其原液直接作為zui高標準濃度,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/mL，臨用前15分鐘內配制,。

如配制100 ng/mL標準品：取0.5ml 200 ng/mL的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采集及保存

1．血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融,。

2．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融,。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設空白孔,、標準孔,、待測樣品孔。除空白孔外,，余孔分別加標準溶液或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡，輕輕混勻,，酶標板加上蓋,，37℃反應120分鐘。

2.         棄去液體,，甩干,，不用洗滌。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul，37℃,60分鐘,。洗板3次,，350ul/每孔,，甩干,。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul，37℃,，60分鐘,，洗板5次，甩干,。

5.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）,。

6.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應（此時蘭色立轉黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4,。測量時先用此孔調OD值至零,。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層

吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內,，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復此過程數(shù)次,。
    自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測豬ANG-1,，且與其它相關蛋白無交叉反應。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1．  洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

3．  請每次測定的同時做標準曲線，做復孔,。

4．  如標本中待測物質含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5．在配制標準品,、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制,，不能混淆,。

6．底物請避光保存。

檢測范圍：

3.1 ng/mL -200 ng/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質,，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結果造成任何影響,。

5．中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。

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