人血管生成素樣蛋白2（ANGPTL2）ELISA試劑盒說明書

本試劑盒僅供體外研究使用!

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人組織勻漿或其它相關(guān)生物液體中血管生成素樣蛋白2（ANGPTL2）含量。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體,，往包被抗ANGPTL2抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗ANGPTL2抗體,、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的ANGPTL2呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.        酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.        標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為50 ng/ml，做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋）后,，分別稀釋成50 ng/ml,，25 ng/ml，12.5 ng/ml,，6.25 ng/ml,，3.12 ng/ml，1.56 ng/ml,，0.78 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。如配制25 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ） 50 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。

3.        樣品稀釋液：1×20ml,。

4.        檢測稀釋液A：1×10ml,。

5.        檢測稀釋液B：1×10ml。

6.        檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100μl/孔）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制。

7.        檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.        底物溶液：1×10ml/瓶。

9.        濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.    終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

11.    覆膜：5張

12.    使用說明書：1份

自備物品

1.   酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說明提前預(yù)熱）

2.   微量加液器及吸頭,，EP管

3.   蒸餾水或去離子水,，全新濾紙

標(biāo)本的采集及保存

1.        組織勻漿：將動物的組織標(biāo)本先用PBS洗滌，去除多余血液,，勻漿化后放在5~10 ml PBS中于-20℃放置過夜,，第二天，經(jīng)過二次反復(fù)凍融破膜,，將勻漿物5000x g離心5分鐘,，取上清即可檢測。

2.        其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過1個月,，-80℃不應(yīng)超過2個月,；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測,。

操作步驟

實驗開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）；試劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時,，應(yīng)對樣品進(jìn)行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。

1.        加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span>100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘,。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2.        棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制）,，酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘。

3.        溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，大約400μl/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。

4.        每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl,，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘。

5.        溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl,，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。

7.        依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng),，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。

8.        用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測,。

注：

1.  試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染,。

2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。一次加樣時間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣,。

3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作,，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時間和溫度,。

4.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水,，同時要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。請配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10μl），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差,；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

6.  反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘）,，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù),。

7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射,。

    建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

洗板方法

1.  手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。

2.  自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人ANGPTL2,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析，如curve expert 1.3,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。

檢測范圍：0.78 ng/ml - 50 ng/ml

zui低檢測限：0.39 ng/mL

說明

1.         在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強(qiáng)光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

2.         試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20℃,，其余試劑短期保存請置于4℃，長期保存則置于-20℃,。

3.         濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4.         剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

5.         所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

6.         有效期：6個月,。

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