豬內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定豬血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或細(xì)胞溶解物中eNOS含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中eNOS水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入eNOS抗原,、生物素化的抗豬NOS抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的eNOS呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，其濃度為10000 pg/mL，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成10000 p/mL,，5000 pg/mL ，2500 pg/mL,，1250 pg/mL,，625 pg/mL，312 pg/mL,，156 pg/mL,，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度 0 pg/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         抗體稀釋液A：1×10ml/瓶,。

5.         抗體稀釋液B：1×10ml/瓶,。

6.         檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液A1：100稀釋。

7.         檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以抗體稀釋液B1：100稀釋,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標(biāo)本的采集及保存

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20℃,，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè),，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔。除空白孔外,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品100ul，輕輕混勻,，37℃,，120分鐘。

2.         棄去液體,，甩干,，不用洗滌。

3.         每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul,，37℃,60分鐘,。洗板3次，350ul/每孔,，甩干,。

4.         每孔加檢測(cè)溶液B工作液 100ul，37℃,，60分鐘,，洗板5次，甩干,。

5.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘。

6.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng),。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。

2．為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層

吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
    自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的豬NOS，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。

注意事項(xiàng)

1．  洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2．  一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

3．  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。

4．  如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高,，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液工作液時(shí),，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。

6．底物請(qǐng)避光保存,。

檢測(cè)范圍：

156 pg/mL -10000 pg/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）,。

2．有效期：6個(gè)月

3．濃洗滌液會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

4．中,、英文說明書可能會(huì)有不一致之處,，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn)。

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