小鼠8羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）ELISA試劑盒

本試劑盒僅供體外研究用                                    

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定小鼠組織勻漿、血清,、血漿,、細胞培養(yǎng)上清,、尿液或其它相關(guān)生物液體中8羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）含量,。

概述

DNA鏈上的堿基鳥嘌呤C-8位易受到羥自由基及單線態(tài)氧的攻擊而發(fā)生羥化,，生成加合物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,，8-OHdG）,。8-OHdG是DNA氧化損傷的特異產(chǎn)物，是*的內(nèi)源性及外源性因素對DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物,。8-OHdG是DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物之一,。在復(fù)制過程中，DNA鏈上8-OHdG可以與C以外的其它堿基配對形成點突變,，其中GC→TA突變的發(fā)生已為大量研究所證實,，并被認為是氧化應(yīng)激因素致癌、致突變的主要機理之一,。機體修復(fù)機制正常時,，8-OHdG可以在hOGG1等酶的作用下從DNA鏈上切除并重新?lián)饺胝５镍B嘌呤堿基,，而切下的8-OHdG則可入血經(jīng)尿液排出體外。8-OHdG在體內(nèi)穩(wěn)定存在,，一旦形成不再被機體進一步代謝,，尿中8-OHdG含量與細胞內(nèi)DNA氧化損傷程度相關(guān)。目前機體8-OHdG水平已被廣泛接受為評價DNA氧化損傷的標(biāo)志物,，并用來估計氧化應(yīng)激相關(guān)癌癥發(fā)生的危險性,。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗8-OHdG抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗8-OHdG抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的8-OHdG呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為5,000 pg/ml，做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）后,，分別稀釋5,000 pg/ml,，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml,，625 pg/ml,，312 pg/ml，156 pg/ml,，78 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制2,500 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）5,000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.   濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.  終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

11.  覆膜：1×5張

標(biāo)本的采集及保存

1.         血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.         血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.         細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4.         組織勻漿：將動物的組織標(biāo)本先用PBS洗滌,，去除多余血液，勻漿化后放在20ml PBS中于-20℃放置過夜,，第二天,，經(jīng)過二次反復(fù)凍融破膜，將勻漿物5000x g離心5分鐘,，取上清即可檢測,。

5.  樣本處理：血清或血漿標(biāo)本推薦稀釋10倍，如：稀釋10倍,，取10ul血清或血漿加入90ul樣品稀釋液,。建議各實驗室在操作前*行預(yù)實驗以建立*稀釋倍數(shù)。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,，-20℃不應(yīng)超過3個月，-80℃不應(yīng)超過6個月；標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測,；高血脂的標(biāo)本不需進行特殊處理，可直接檢測,。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭辉噭┗驑悠废♂寱r,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如樣品濃度過高時,，均應(yīng)用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。建議各實驗室在操作前*行預(yù)實驗以建立*稀釋倍數(shù),。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘,。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2.         棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（在使用前一小時內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃,，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng),，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后立即進行檢測,。

注：

1.         每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔（不同于空白孔），該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2.         嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達到室 溫,。使用后立即冷藏保存試劑。

3.         洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果,。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作,，避免酶標(biāo)板長時間處于干燥狀態(tài)。

4.         消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值,。

5.在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

6.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，請配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10ul）,，以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差,；檢測液A、B,，以及底物溶液在使用前,，應(yīng)置于37℃溫育30分鐘；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

7.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需

要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠8羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線（推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3）,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1.         洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

2.         一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣。

3.         請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。

4.         如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5.         在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。

6.         底物請避光保存,。

檢測范圍：78 pg/ml - 5,000 pg/ml

zui低檢測限：39 pg/ml

說明

1.          在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染，試劑避免受到微生物的污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果,。

2.          小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。而且，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果,。

3.          試劑盒保存：短期（2周以內(nèi)）以標(biāo)簽上的標(biāo)示為準(zhǔn),，長期保存請將試劑全部保存于-20℃。

4.          濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

5.          剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

6.          所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。

7.          有效期：6個月

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