ELISA試劑盒說明書-人全段甲狀旁腺激素（I-PTH）

本試劑盒僅供研究使用                                       

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關(guān)液體中全段甲狀旁腺激素（I-PTH）含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

PTH是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的含有84個氨基酸的直鏈肽，分子量為9000,，其生物活性決定于N端的第1-27個氨基酸殘基,。在甲狀旁腺主細(xì)胞內(nèi)先合成一個含有115個氨基酸的前甲狀旁腺激素原（pre pro-PTH），以后脫掉N端二十五肽,，生成九十肽的甲狀旁腺激素原（pro-PTH）,，再脫去6個氨基酸，變成PTH,，PTH釋放入血后稱全段PTH（intact PTH,，I-PTH）。

本試劑盒采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中I-PTH水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入I-PTH抗原、生物素化的抗人I-PTH抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的I-PTH呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為1000 pg/ml,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成1000 pg/ml，500 pg/ml ,，250 pg/ml,，125 pg/ml，62.5 pg/ml,，31 pg/ml,，15.6 pg/ml，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制500 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 1000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可,，其余濃度以此類推。

2.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

3.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

5.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul）,，實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。

6.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。

7.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

8.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

9.         終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標(biāo)本的采集及保存

1．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫,。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔,。除空白孔外,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul，注意不要有氣泡,，輕輕混勻,，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘,。

2.         棄去液體,，甩干，不用洗滌,。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul,，37℃,60分鐘。洗板3次,，350ul/每孔,，甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul,，37℃,，60分鐘，洗板5次，甩干,。

5.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯）,。

6.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人I-PTH,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。

注意事項

1．  洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

3．  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。

4．  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。

6．底物請避光保存,。

檢測范圍：

15.6 pg/ml -1000 pg/ml

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）,；2-8℃（頻繁使用時）。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

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