ELISA試劑盒使用說明書-大鼠水通道蛋白4（AQP4）

本試劑盒僅供研究使用

產(chǎn)品編號：E0582r                                           

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定大鼠血清,、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中AQP4含量,。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中AQP4水平。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入AQP4抗原、生物素化的抗大鼠AQP4抗體,、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的AQP4呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為10 ng/mL,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋成10 ng/mL，5 ng/mL ,，2.5 ng/mL,，1.25 ng/mL，0.62 ng/mL,，0.31 ng/mL,，0.15 ng/mL，其原液直接作為zui高標(biāo)準(zhǔn)濃度,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/mL,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制5 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10 ng/mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液A 1：100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測稀釋液B1：100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標(biāo)本的采集及保存

1．細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃,，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血清：標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項檢測,。

操作步驟

各試劑在使用前平衡至室溫,。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔,。除空白孔外，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，輕輕混勻,，酶標(biāo)板加上蓋，37℃反應(yīng)120分鐘,。

2.         棄去液體,，甩干，不用洗滌,。

3.         每孔加檢測溶液A工作液 100ul,，37℃,60分鐘。洗板3次,，350ul/每孔,，甩干。

4.         每孔加檢測溶液B工作液 100ul,，37℃,，60分鐘，洗板5次,，甩干,。

5.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色30分鐘（此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯）,。

6.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時蘭色立轉(zhuǎn)黃色）,。用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。

注：

1． 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH₂SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2．為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的大鼠AQP4，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。

注意事項

1．  洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

3．  請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。

4．  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時,，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。

6．底物請避光保存,。

檢測范圍：

0.15 ng/mL -10 ng/mL

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）,。

2．有效期：6個月

3．濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

5．中,、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn),。

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