人腎損傷分子1（Kim-1）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供體外研究使用!

預期應用

ELISA法定量測定人尿液或其它相關生物液體中腎損傷分子1（Kim-1）含量。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗Kim-1抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗Kim-1抗體,、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的Kim-1呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.        酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.        標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 ng/ml，將其稀釋為50 ng/ml后,，再做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）,，分別稀釋成50 ng/ml，25 ng/ml,，12.5 ng/ml,，6.25 ng/ml，3.12 ng/ml,，1.56 ng/ml,，0.78 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。如配制25 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）50 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

3.        樣品稀釋液：1×20ml。

4.        檢測稀釋液A：1×10ml,。

5.        檢測稀釋液B：1×10ml,。

6.        檢測溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（100μl/孔）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如10μl檢測溶液A加990μl檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制,。

7.        檢測溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.        底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.        濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.    終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

11.    覆膜：5張

12.    使用說明書：1份

自備物品

1.   酶標儀（建議參考儀器使用說明提前預熱）

2.   微量加液器及吸頭，EP管

3.   蒸餾水或去離子水,，全新濾紙

標本的采集及保存

1.        尿液：請收集清晨*次尿液（中段尿）,，或24小時尿液，2000 x g離心15分鐘后收集上清,，并將標本保存于-20℃,，且應避免反復凍融。

2.        其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。

注：以上標本置4℃保存應小于1周,，-20℃或-80℃均應密封保存,，-20℃不應超過1個月，-80℃不應超過2個月,；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

操作步驟

實驗開始前,，各試劑均應平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）,；試劑或樣品稀釋時,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量,，如樣品濃度過高時,，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,，計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù),。

1.        加樣：分別設空白孔、標準孔,、待測樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,，余孔分別加標準品或待測樣品100μl,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘,。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液,。

2.        棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100μl（在使用前一小時內(nèi)配制）,，酶標板加上覆膜, 37℃反應60分鐘。

3.        溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，大約400μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.        每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100μl,，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘,。

5.        溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.        依序每孔加底物溶液90μl,，酶標板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。

7.        依序每孔加終止溶液50μl，終止反應,，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性,，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。

8.        用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進行檢測,。

注：

1.  試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫,，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭,，避免交叉污染,。

2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標本 / 標準品,，酶結(jié)合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的 “預孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣,。

3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài);同時應嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。

4.   洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上充分拍干,，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù),。

5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標準品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，并使用相應的稀釋液配制,，不能混淆。請配置標準品及工作液,，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl）,，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

6.  反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘），如顏色較深,，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應,，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。

7.  底物：底物請避光保存,，在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

    建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性,。

    如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

洗板方法

1.  手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次,。

2.  自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人Kim-1,，且與其它相關蛋白無交叉反應,。

計算

  以標準物的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標），OD值為橫坐標（對數(shù)坐標）,，在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度,。

檢測范圍：0.78 ng/ml - 50 ng/ml

zui低檢測限：0.39 ng/ml

說明

1.         在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

2.         試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標準品,、檢測溶液A和檢測溶液B保存于-20℃,，其余試劑短期保存請置于4℃，長期保存則置于-20℃,。

3.         濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

4.         剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

5.         所有的樣品都應管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

6.         有效期：6個月,。

7.         本操作說明適用于48T試劑盒,，但48T試劑盒所有試劑減半。

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