人過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（PPAR-γ）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用                                       

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)液體中過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（ PPAR-γ）含量。

實驗原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標免疫分析法測定標本中PPAR-γ水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被單抗的微孔中依次加入PPAR-γ抗原,、生物素化的抗人PPAR-γ抗體、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的PPAR-γ呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為20,000 pg/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋20,000 pg/ml,，10,000 pg/ml，5,000 pg/ml,，2,500 pg/ml,，1,250 pg/ml，625 pg/ml,，312 pg/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制10,000 pg/ml標準品：取0.5ml 20,000 pg/ml 的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標本的采集及保存

1.  細胞培養(yǎng)物上清：請離心后收集上清,，并將標本保存于-20℃，且應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

2.  血清：標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測,。

操作步驟

實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r,，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線,。如樣品濃度過高時,，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔,、標準孔、待測樣品孔,?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘,。

為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。

3.         溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃，60分鐘,。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）,。

7.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液,。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1.         每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。

2.         為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜,。

3.         未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存。標準品,、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

4.         建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需

要，重復(fù)此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人PPAR-γ,，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標）,，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

3. 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔,。

4. 如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5. 在配制標準品,、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。

6. 底物請避光保存,。

檢測范圍：

312 pg/ml - 20,000 pg/ml

說明

1.         試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時，僅適用于部分試劑）,；2-8℃（頻繁使用時）,。

2.         有效期：6個月

3.         濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

4.         剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

5.         中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。

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