廈門慧嘉生物科技專業(yè)代理和經(jīng)銷眾多生命科學(xué)領(lǐng)域的。致力于各種生物試劑、抗體、ELISA試劑盒,、耗材、儀器的銷售推廣及服務(wù)工作,。ELISA試劑盒,，代理國外R&D、UCL,、RB,、GBD等各品牌試劑盒。各種標(biāo)本,、種屬,、具體指標(biāo)齊全,。種屬非常齊全：種屬類有：人,、家畜類、水產(chǎn)類,、禽類,、寵物類、植物類,、毒品檢測及花類等等（如人,、大鼠、小鼠,、豚鼠,、豬、狗,、猴,、羊、牛,、雞,、兔）；標(biāo)本種類較多：血清血漿,、全血,、細(xì)胞上清液、組織勻漿,、體液,、尿液、肺泡灌洗液,、糞便,、心房水,、胸腹水、腦脊髓,、前列腺液,、精液、陰道分泌物等等,；

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人8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測定人血清,、血漿或其它相關(guān)液體中8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）含量,。

概述

DNA鏈上的堿基鳥嘌呤C-8位易受到羥自由基及單線態(tài)氧的攻擊而發(fā)生羥化，生成加合物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,，8-OHdG）,。8-OHdG是DNA氧化損傷的特異產(chǎn)物，是*的內(nèi)源性及外源性因素對(duì)DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物,。8-OHdG是DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物之一,。在復(fù)制過程中，DNA鏈上8-OHdG可以與C以外的其它堿基配對(duì)形成點(diǎn)突變,，其中GC→TA突變的發(fā)生已為大量研究所證實(shí),，并被認(rèn)為是氧化應(yīng)激因素致癌、致突變的主要機(jī)理之一,。機(jī)體修復(fù)機(jī)制正常時(shí),，8-OHdG可以在hOGG1等酶的作用下從DNA鏈上切除并重新?lián)饺胝５镍B嘌呤堿基，而切下的8-OHdG則可入血經(jīng)尿液排出體外,。8-OHdG在體內(nèi)穩(wěn)定存在,，一旦形成不再被機(jī)體進(jìn)一步代謝，尿中8-OHdG含量與細(xì)胞內(nèi)DNA氧化損傷程度相關(guān),。目前機(jī)體8-OHdG水平已被廣泛接受為評(píng)價(jià)DNA氧化損傷的標(biāo)志物,，并用來估計(jì)氧化應(yīng)激相關(guān)癌癥發(fā)生的危險(xiǎn)性。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中8-OHdG水平,。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入8-OHdG抗原,、生物素化的抗人8-OHdG抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的8-OHdG呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為20,000 pg/ml,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋10,000 pg/ml，5,000 pg/ml,，2,500 pg/ml,，1,250 pg/ml，625 pg/ml,，312.5 pg/ml,，156 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制10,000 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 20,000 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶,。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標(biāo)本的采集及保存

1.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清,，并將標(biāo)本保存于-20℃,，且應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.  血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡,。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí),，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2.         棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（取1ul檢測溶液A加99ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘,。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul,，37℃,，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測,。

注：

1.         每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4,。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零。

2.         為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

3.         未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請(qǐng)于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用,。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

4.         建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定,，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需

要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測重組或天然的人8-OHdG，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng),。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度,。

注意事項(xiàng)

1.         洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2.         一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

3.         請(qǐng)每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔。

4.         如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請(qǐng)先稀釋后再測定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.         在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時(shí),，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。

6.         底物請(qǐng)避光保存,。

檢測范圍：

156 pg/ml - 10,000 pg/ml

說明

1.         試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí),，僅適用于部分試劑）；2-8℃（頻繁使用時(shí)）,。

2.         有效期：6個(gè)月

3.         濃洗滌液會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。

4.         剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì),，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響,。

5.         中,、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn),。

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