抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體檢測(cè)

    抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體對(duì)SLE有較高的特異性,，因此美國(guó)及中國(guó)對(duì)SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)中都已列入抗ds-DNA測(cè)定,。檢測(cè)抗ds-DNA的方法很多,，如免疫沉淀（雙向擴(kuò)散與對(duì)流免疫電泳）,、間接血凝,、間接熒光抗體（DNA斑點(diǎn)法,、短膜蟲(chóng)法）,、間接酶標(biāo)抗體染色（短膜蟲(chóng)）、ELISA,、RIA等?，F(xiàn)應(yīng)用較多的是RIA（Farr法）、ELISA,、間接熒光抗體（短膜蟲(chóng)）法（CL-IFA）,。

    蘭小鵬等（1994）以純化的大腸桿菌質(zhì)粒ds-DNA為抗原，利用親合素—生物素系統(tǒng)（BAS）,，將其結(jié)合在硝酸纖維素（NC）膜上,，建立了一種新型的檢測(cè)ds-DNA抗體的斑點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)（dot immunobinding assay，DIBA）,。DIBA的敏感性?xún)?yōu)于CL-IFA,，特異性?xún)?yōu)于ELISA試劑盒,。DIBA檢測(cè)ds-DNA快速、簡(jiǎn)便,、可靠,，如有試劑盒供應(yīng)，可作為檢測(cè)ds-DNA抗體的常規(guī)方法?，F(xiàn)將DIBA檢測(cè)ds-DNA法介紹如下,。

    1．試劑  生物素化質(zhì)粒ds-DNA：將含質(zhì)粒pBR332的大腸桿菌在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，取純培養(yǎng)物用Magic^TM DNA純化系統(tǒng),，按Promega公司所附操作說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒ds-DNA,。取純化的不含單鏈DNA的大腸桿菌質(zhì)粒ds-DNA直接與長(zhǎng)臂光敏生物素混合，用光標(biāo)記燈進(jìn)行光照標(biāo)記,，以制備生物素化質(zhì)粒ds-DNA,。可參考以下步驟：在一滅菌EP管中加待標(biāo)記DNA 5ug／10uL,，在暗室中加入5ug／uL光敏生物素,，充分混勻，置冰浴中,。

    在特制光源下10cm處照射20min,。加入100mmol／LTris-HCl，pH9．0（含0．1mmol／LEDTA）10uL,，混勻,。再加入等體積仲丁醇，混勻,。離心lmin（10 000r／rain）,，吸去上層仲丁醇，棄去,。再加入仲丁醇25uL,，重復(fù)提取游離的光敏生物素。吸去上層無(wú)色仲丁醇后,，加入5uL3mol／L醋酸鈉,，充分混勻，加入冷*100gL充分混勻,，沉淀標(biāo)記的DNA,，置-20℃過(guò)夜（或-70℃l5min），15 000r／min離心20min,，沉淀物再用70％乙醇洗1次,，離心，抽干,，溶于0．1mmol／LEDTA或TK中,，測(cè)定探針濃度,，分裝，保存于-20℃,。

    2．操作步驟

    （1）DIBA反應(yīng)板制作  取厚約0．5mm的硬質(zhì)透明膠片,，用打孔器打直徑為3mm的圓孔，在膠片一面貼透明膠紙,，取與膠板上的圓孔等大的NC片,，嵌貼人上述膠板的孔內(nèi)即成DIBA微量反應(yīng)板,。NC片經(jīng)0．01mol／L,，pH7．4PBS濕潤(rùn)后，加入如L親合素（50ug／mL）,，37℃干燥,。再加生物素化的質(zhì)粒ds-DNA（25ug／mL），37％30min,，用含3％BSA的PBS封閉30min,；經(jīng)含0．05％Tween-20的PBS漂洗后，吹干,，置冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>

    （2）標(biāo)本檢測(cè)  在上述NC片上加入用含3％BSA的PBS 1：40稀釋的待檢血清,，37℃反應(yīng)30rain，振蕩漂洗,；加羊抗人ISC-HRP（1：100）,，37~Clh；漂洗后加底物（DAB-H20）,，顯色,。

    （3）結(jié)果判定  以NC片*出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)為陽(yáng)性，陽(yáng)性強(qiáng)弱以出現(xiàn)棕色斑點(diǎn)的血清zui高稀釋度表示,，血清1：40稀釋時(shí)*不顯色則為陰性,。

    3．臨床意義  抗ds-DNA抗體的檢測(cè)對(duì)于SLE的診斷和治療監(jiān)控極為重要。其他結(jié)締組織性疾病患者抗ds-DNA也可出現(xiàn)陽(yáng)性,，但此類(lèi)病人一般是SLE重疊綜合征,，故抗ds-DNA抗體是SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。

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