酶聯(lián)免疫測定（ELISA）標(biāo)準(zhǔn)化的一般原則

    對酶聯(lián)免疫測定標(biāo)準(zhǔn)化的目的就是通過這種標(biāo)準(zhǔn)化以改善實(shí)驗(yàn)室測定的準(zhǔn)確度,，從而提高不同的實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的可比性。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的先決條件是,，標(biāo)準(zhǔn)品和檢測物應(yīng)該是相同的,，否則標(biāo)準(zhǔn)化就無從談起,。這在目前的許多臨床免疫測定項目中標(biāo)準(zhǔn)品往往沒有達(dá)到這一要求,。

    涉及到免疫測定標(biāo)準(zhǔn)化的組織有世界衛(wèi)生組織（WHO）生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化專家委員會（ECBS），其負(fù)責(zé)建立生物物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)及參比材料,。WHO通過國家生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控物研究所（NIBSC）提供大多數(shù)多肽激素和一些腫瘤標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品,。一些區(qū)域和地區(qū)性組織也制備標(biāo)準(zhǔn)品，如美國的疾病控制中心（CDC）,、美國病理學(xué)家協(xié)會（CAP）的國家委員會,。國家衛(wèi)生研究所（NIH）提供尤其是用于研究目的的多肽激素標(biāo)準(zhǔn)品,。IFCC也已組織制備了一種脂蛋白和血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品,，可通過CAP得到,。癌發(fā)生生物學(xué)和醫(yī)學(xué)學(xué)會已啟動一個腫瘤標(biāo)志物的決定計劃。在國內(nèi)中國藥品生物制品檢定所提供一些多肽激素,、腫瘤標(biāo)志物等標(biāo)準(zhǔn)品。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心則為全國各級醫(yī)院血站實(shí)驗(yàn)室提供室內(nèi)質(zhì)控物,。盡管僅僅使用標(biāo)準(zhǔn)品并不能保證免疫測定結(jié)果的可比性,，但標(biāo)準(zhǔn)品對保證免疫測定的重要性是不言而喻的。目前在世界上有各種不同的科學(xué)協(xié)會如IFCC及國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）以及美國和加拿大臨床化學(xué)協(xié)會（AACC和CSCC）等正致力于免疫測定的標(biāo)準(zhǔn)化工作,，這些組織也制備一些標(biāo)準(zhǔn)品,。在美國，免疫測定必須有食品和藥物管理局（FDA）的批準(zhǔn),。在德國的監(jiān)督機(jī)構(gòu)是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化和文件化研究所（INSTAND）,。在國內(nèi)免疫診斷試劑的審批由國家*（SDA）負(fù)責(zé)。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心也正在著手臨床免疫檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化方面的工作,。

    *代生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品是在70多年前由Henry Dale制備的用于胰島素測定的標(biāo)準(zhǔn)品,，該標(biāo)準(zhǔn)品被WHO的前身即國家衛(wèi)生組織聯(lián)合會（League Of National Health Organization）所采用。從那時起,，在一系列標(biāo)準(zhǔn)品（IS）中胰島素制劑的含量以單位（IU）表示,，每一個標(biāo)準(zhǔn)品均用前一個進(jìn)行校準(zhǔn)。其后,，對大多數(shù)重要的多肽激素和其他具有“復(fù)雜分子組成的物質(zhì)”（即不能僅通過使用物理和化學(xué)方法*鑒定其均一性,、效力或安全性的物質(zhì)）均制備了標(biāo)準(zhǔn)品。每一種IS的單位由ECBS在合作研究的基礎(chǔ)上確定,。并評估提出來作為一種IS的制劑在不同的試驗(yàn)系統(tǒng)中的適用性,。生物試驗(yàn)主要是用于多肽激素標(biāo)準(zhǔn)的評價和使用以前的舊標(biāo)準(zhǔn)晶對新標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)。因此,，單位通常表示生物活性,，但其也用于缺乏已知生物活性的物質(zhì)。通常標(biāo)準(zhǔn)品的制備批量應(yīng)至少夠用10—20年,。

    對于臨床分析測定來說,，標(biāo)準(zhǔn)品和參考制劑可用作校準(zhǔn)物，而在每個具體的實(shí)驗(yàn)室中,，其可用來評價試驗(yàn)的有效性,，以及作為室內(nèi)質(zhì)控樣本,，對測定的質(zhì)量評價來說，也是非常有價值的,。術(shù)語“IS”取代了已被WHO用于某些標(biāo)準(zhǔn)品的術(shù)語“參考制劑”（IRP）,。目前使用的人絨毛膜促性腺激素（hCG）剛開始被稱為*代IRP，后來被稱為第三代IS,。盡管大多數(shù)IS制劑由溶解在含一載體蛋白的緩沖液中的純抗原所組成,，但某些標(biāo)準(zhǔn)品（如血清蛋白）是以血清作為基質(zhì)材料的。標(biāo)準(zhǔn)品可歸類為*,、第二和第三等三個等級,。一級標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量有限，可使用10～20年,，為凍干品,，內(nèi)含載體蛋白。一級標(biāo)準(zhǔn)可用來校準(zhǔn)第二和第三級標(biāo)準(zhǔn),，例如,，常規(guī)測定中使用的校準(zhǔn)品。IS可作為*級標(biāo)準(zhǔn)品,，一旦*級標(biāo)準(zhǔn)確定,，二級標(biāo)準(zhǔn)可用來維持校準(zhǔn)。校準(zhǔn)的二級標(biāo)準(zhǔn)可在以國家為基礎(chǔ)的范圍內(nèi)供應(yīng),。標(biāo)準(zhǔn)品的特性應(yīng)該清楚明確，理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)該是純的但仍需有特定分析物質(zhì)可能的同種型不均一性,，這種要求通常難以達(dá)到,，因?yàn)樵诩兓^程中，使用生化方法去除雜質(zhì)會引起少量的同種型丟失,。免疫親和層析純化方法可用來提取所有特異的同種型,，但洗提過程常需在低pH變性條件下進(jìn)行，這種變性條件可能會引起某些蛋白的不可逆修飾,。免疫親和層析純化方法也可使用在細(xì)胞系統(tǒng)中表達(dá)生成的蛋白,，但表達(dá)產(chǎn)物仍需純化和糖基化，而糖基化又可能與天然蛋白有所不同,。

    目前可得到的標(biāo)準(zhǔn)品中特定分析物的濃度一般以U／L表示,，而已經(jīng)很明確的物質(zhì)如類固醇和甲狀腺激素，則應(yīng)以物質(zhì)濃度（m01／L）表示,。但已很明確的肽類激素的數(shù)量也正在不斷增加,，因此，雖然促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和胰島素已有標(biāo)準(zhǔn)品,，但其濃度常以m01／L或g／L而不是U／L來表示,。鑒定明確的腫瘤標(biāo)志物的濃度常以質(zhì)量濃度（g／L）表示,，而不太明確的標(biāo)志物則以的單位（U／L）表示。激素濃度以U／L表示會給人這樣一個印象,，即所測定的是具有生物學(xué)活性的激素的濃度,，但免疫測定并不能測定生物活性，其實(shí)際上測定的是抗原上一個決定基（epitope）或一組決定基的摩爾濃度,，尤其是使用單克隆抗體進(jìn)行測定時,。因此，質(zhì)量濃度（以m01／L表示）zui能確切地反映所測定的是什么,。即使蛋白的糖的組成和等電點(diǎn)不均一,，氨基酸分析也可準(zhǔn)確地測定純化蛋白的含量。糖蛋白質(zhì)量的稱重測定是不準(zhǔn)確的,，因?yàn)槠浜薪Y(jié)合很緊的水,，凍干并不能去除。第四代hCG標(biāo)準(zhǔn)品將通過氨基酸分析的方法來測定,，以m01／L來表示,，至于將現(xiàn)有的第三代標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換至第四代的轉(zhuǎn)換因子可通過免疫測定進(jìn)行交叉校準(zhǔn)確定。如果一個免疫試驗(yàn)測定分子量不同但免疫反應(yīng)性相同的同一物質(zhì)的不同分子變異體,，則質(zhì)量濃度可正確地反映不同成分的濃度,，然而，如果不同的分子形式?jīng)]有相等的免疫反應(yīng)性,，則質(zhì)量濃度也會出現(xiàn)偏差,，該問題可通過使用具有適當(dāng)特異性的抗體和標(biāo)準(zhǔn)品來解決。

    當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)晶更換時也會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化方面的問題,，一個新的標(biāo)準(zhǔn)品可能會改變診斷免疫試驗(yàn)的效果估價,，盡管已進(jìn)行了仔細(xì)的校準(zhǔn)。使用生物試驗(yàn)校準(zhǔn)激素標(biāo)準(zhǔn)品頗為復(fù)雜,，生物試驗(yàn)較之免疫試驗(yàn)的重復(fù)性要差,，對免疫反應(yīng)性影響不大的激素的糖組成成分對其生物活性卻影響較大，用于體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)的效果是不一樣的,。如果一新的激素標(biāo)準(zhǔn)品是根據(jù)生物活性來進(jìn)行校準(zhǔn)的,，則將其用于免疫測定時會有所不同。如卵泡刺激激素標(biāo)準(zhǔn)FSH83／575用于FSH免疫測定校準(zhǔn)時,，其變化因子為4,，但催乳激素、促黃體生成激素（LH）和生長激素則不引起或只引起很小的改變,。

    從一級標(biāo)準(zhǔn)的值傳遞到zui終試驗(yàn)所使用的校準(zhǔn)物的過程通常由幾個校準(zhǔn)步驟組成,，包括標(biāo)準(zhǔn)品和測定方法、緩沖液及其基質(zhì),、稀釋的控制,、zui終結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)評價和質(zhì)量控制等,。當(dāng)建立一個測定方法時，一級標(biāo)準(zhǔn)品的值要傳遞至二級,、三級和（或）校準(zhǔn)品,，使得所建立的方法的測定值可溯源至一級標(biāo)準(zhǔn)品。當(dāng)引入一批新的試劑時,，即需要重復(fù)這種傳遞過程,，從而保持校準(zhǔn)的可靠性。不同的分析物如血清蛋白,、多肽激素或與載體蛋白結(jié)合的低分子量激素等其校準(zhǔn)過程有所不同,。

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