辣根過氧化物酶的色原底物

    HRPzui常用的色原底物有鄰苯二胺（OPD）,、2，2’—吖嗪—（3—乙酰苯基噻唑磺酸—6）[2，2’—azino-di（3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6），ABTS]（雜環(huán)吖嗪）,、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和4—氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對等。上述色原底物受HRP作用主要有兩種形式的反應：①氧化還原底物的氧化作用,，如OPD,、ABTS等；②一個氨基芳香劑與另一個芳香基化合物的氧化耦聯(lián),，如4—氨基安替比林：苯酚等,。

    （一）氧化還原色原底物

    OPD被認為是HRPzui為敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下,，由過氧化氫（H₂0₂）

氧化而聚合成2,，2’—二氨基偶氮苯（DAB）。在pH5．0左右時,，DAB在波長450nm處有廣范圍的zui大吸收,，當pH值降為1．0時，zui大吸收波長移動至492nm,，同時摩爾消光系數(shù)變大，顯色加深（圖4—2）,。因而常用強酸如硫酸或鹽酸終止反應,。實際工作中，用強酸尤其是鹽酸終止反應后,，顯色并不穩(wěn)定,，常隨時間增長而顏色加深，這是由于反應后剩余的過氧化氫繼續(xù)氧化OPD而產(chǎn)生非酶催化的DAB的結(jié)果,。有人在強酸反應終止液中加入還原劑如亞硫酸鈉,，因還原劑可迅速*地將剩余的過氧化氫還原而阻止了OPD的非酶氧化，結(jié)果顯色穩(wěn)定,，數(shù)十小時內(nèi)不變,，而且無需避光,。OPD的缺點是其對機體具有致突變作用。由于OPD的不穩(wěn)定性,，現(xiàn)在的商品試劑盒中,，OPD均以片劑或粉劑供應，臨用時再溶解于相應的緩沖液,。

    在ELISA測定時,，OPD色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：在0．1mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH5．0）中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H₂0₂，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H₂0₂,；②終止液：2 mol／L硫酸（含0．1 mol／L亞硫酸鈉）,；③測定波長：492nm。

    TMB是一種優(yōu)于OPD的新型HRP色原底物,。其氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長450nm處有zui大消光系數(shù),，如果HRP量少，過氧化氫溶液和TMB過量時,，則形成藍色的陽離子根,。降低pH，即可使藍色的陽離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌（圖4—3）,。使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min,，但隨后本底顯色就不斷加深，國內(nèi)有人認為使用1％SDS作為終止劑,，可使鮮藍色24h內(nèi)保持不變,，陰陽性對比十分明顯，但在我們實驗室發(fā)現(xiàn)1％SDS對上述顯色有較強的褪色作用,，目前仍以硫酸作為終止劑較為理想,。ELISA中，底物反應顯色后,，常選擇其具zui大吸收的波長450nm比色測定結(jié)果,。而’Madersbacher和Berger等為提高以TMB作底物的ELISA測定的敏感性，選擇顯色呈指數(shù)加深時的波長405nm比色測定,。他們首先測定一系列已知濃度的標準品在450nm和405nm的值,，證實A450nm／A405nm之比為3．2，然后在使用波長405nm測定含低濃度待測物的標本得到的OD值再乘以常數(shù)3．2,，即為待測標本在波長450nm處的真值,。該種雙波長測定方法可使ELISA測定范圍提高3倍。TMB的顯色反應雖與OPD一樣同屬氧化還原反應,，但前者的反應是可逆的,，如終止液中存在還原劑（維生素C及亞硫酸鈉、SDS等）,，則可反應顯色迅速消退,。TMB雖然溶解度相對較低,，但由于其高檢測敏感性及無致突變作用，現(xiàn)已基本上取代了OPD而成為HRPzui為常的色原底物,。

    在商品ELISA試劑盒尤其是國內(nèi)的產(chǎn)品中,，TMB色原底物常為已配好的A及B兩種液態(tài)試劑，其中一種是含一定濃度過氧化氫的溶液,，一種為TMB溶液,，鑒于過氧化氫、TMB在溶液中相對不穩(wěn)定的特點,，因此,，我們在使用ELISA試劑盒時，如發(fā)現(xiàn)底物A和（或）B出現(xiàn)顏色,，或二者各取一滴混合后顯色,，說明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染，必須廢棄,。

    在ELISA測定時,，TMB色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將TMB以0．1 mol／L的濃度溶于二甲亞砜，然后,，再將其以1 mmol／L和H₂0₂以3．0 mmol／L的濃度溶于0．2mol／L醋酸鈉／枸櫞酸緩沖液（pH4．0）,，即可應用。②終止液：2 mol／L硫酸,。③測定波長：450nm,。

    ABTS也是HRP的一種高靈敏底物。在H：O：存在下,，ABTS的氨鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橐装l(fā)生歧化的陽離子根（圖4—4）,。陽離子根為綠色，與OPD的黃色氧化產(chǎn)物相比更適于可見光測定（測定波長入＝414nm）,。上述顯色也不穩(wěn)定,，10 mmol／L疊氮鈉是較為理想的終止劑，可使顯色穩(wěn)定數(shù)十小時,，且可減少陽離子根的歧化,。另有人報道用1．25％NaF終止反應效果較好。

    ABTS在目前國內(nèi)的ELISA試劑盒中基本上沒有應用,，但在國外ELISA試劑盒偶見有應用。

    在ELISA測定時,，ABTS色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將ABTS以2 mmol／L和H₂0₂以2．5 mmo!／L的濃度溶于0．1 mol／L醋酸鹽緩沖液（pH 4．2）,，即可應用；②終止液：10 mmol／L疊氮鈉,；③測定波長,；414nm或405nm,。

    除上述三種外，HRP的氧化還原底物尚有O-dianisidine（ODA）,，5—氨基水楊酸（5—AS）以及dicarboxindine等,。

    （二）氧化耦聯(lián)色原底物對

HRP的氧化耦聯(lián)色原底物對主要有4—氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯(lián)底物對（Ngo—Lenhoff試劑）等,。

    在H₂0₂存在下,，4—氨基安替比林和苯酚經(jīng)HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺，其在入＝492 nm處有zui大吸收（圖4—5）,。

    該耦聯(lián)色原底物對用于固相ELISA時,，敏感性一般較低，反應見光不穩(wěn)定,，而且苯酚易發(fā)生多聚化,，缺乏適當?shù)姆磻K止劑。因此,，該試劑常限于葡萄糖,、三酰甘油、肌酸激酶等臨床生化指標的酶法檢測應用,。1989年日本學者用其作為色原底物建立了一種以HRP作標記酶的均相酶免疫試驗,，可用甲醛終止反應。但這種方法僅停留在實驗室階段,，其后也未見有其他實驗室的應用報道,，可能還有其固有的缺陷。

    4—氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將4—氨基安替比林以2 mmol／L,，苯酚以25 mmol／L和H₂0₂以0．8 mmol／L的濃度溶于0．1 mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7．2）,，即可應用；②終止液：未見報道,；③測定波長：492nm,。

    MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍色的吲達胺（indamine），zui大吸收波長為590nm,，見光不穩(wěn)定,。用鹽酸或硫酸終止反應后，pH應為3．0左右,，pH值的降低使顯色從紫藍色轉(zhuǎn)變?yōu)榍逦乃{色,，zui大吸收波長從590nm變?yōu)?/span>595nm，然而pH值的進一步降低,，將導致光吸收消失,。

    MBTH：DMA耦聯(lián)對在固相ELISA測定幾乎沒有應用。

廈門慧嘉生物科技有限公司專業(yè)提供各品牌ELISA試劑盒
詳情請登入: http://www.biohj.com
http://www.biohj.com/product.aspx?cid=1  

查詢，或    ：[email protected]