人腎病蛋白（nephrin）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定人血清,、血漿或其它相關(guān)液體中Nephrin含量,。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中Nephrin水平。用純化的抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被抗體的微孔中依次加入Nephrin抗原、生物素化的抗人Nephrin抗體,、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Nephrin呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測(cè)定吸光度（OD值）,，計(jì)算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為10 ng/ml,，做系列倍比稀釋后，分別稀釋成10 ng/ml,，5 ng/ml ,，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml,，0.625 ng/ml,，0.312 ng/ml,，0.156 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml,，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制5 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml 10 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可,，其余濃度以此類推,。

2.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

3.         檢測(cè)稀釋液A：1×10ml/瓶,。

4.         檢測(cè)稀釋液B：1×10ml/瓶,。

5.         檢測(cè)溶液A：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1：100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。

6.         檢測(cè)溶液B：1×120ul/瓶（1：100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B1：100稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液A,。

7.         底物溶液：1×10ml/瓶,。

8.         濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

9.         終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。

標(biāo)本的采集及保存

1．血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè),，或?qū)?biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2．血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡,。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍,。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120分鐘,。

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2.         棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加檢測(cè)溶液A工作液 100ul（取1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）,，37℃,60分鐘,。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔，甩干,。

4.         每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液） 100ul,，37℃，60分鐘,。

5.         溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干,。

6.         依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè),。

注：

1． 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2NH2SO4,。測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD值至零,。

2．為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,。

3.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用,。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。

4.  建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定,，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需

要,，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人Nephrin，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,，OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。

注意事項(xiàng)

1．  洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性。

2．  一次加樣時(shí)間控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

3．  請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，做復(fù)孔,。

4．  如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù),。

5．在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí),，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。

6．底物請(qǐng)避光保存,。

檢測(cè)范圍：

0.156 ng/ml -10 ng/ml

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）,；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2．有效期：6個(gè)月

3．濃洗滌液會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

5．中,、英文說明書可能會(huì)有不一致之處，請(qǐng)以英文說明書為準(zhǔn),。

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