ELISA檢測(cè)中常見的酶及底物

辣根過氧化物酶HRP

    HRPzui常用的色原底物有鄰苯二胺（OPD）,、2，2’—吖嗪—（3—乙酰苯基噻唑磺酸—6）[2,，2’—azino-di（3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6），ABTS]（雜環(huán)吖嗪）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和4—氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對(duì)等,。上述色原底物受HRP作用主要有兩種形式的反應(yīng)：①氧化還原底物的氧化作用,，如OPD,、ABTS等；②一個(gè)氨基芳香劑與另一個(gè)芳香基化合物的氧化耦聯(lián),，如4—氨基安替比林：苯酚等,。

    （一）氧化還原色原底物

    OPD被認(rèn)為是HRPzui為敏感的色原底物之一，其在HRP的作用下,，由過氧化氫（H₂0₂）

氧化而聚合成2,，2’—二氨基偶氮苯（DAB）。在pH5．0左右時(shí),，DAB在波長(zhǎng)450nm處有廣范圍的zui大吸收,，當(dāng)pH值降為1．0時(shí)，zui大吸收波長(zhǎng)移動(dòng)至492nm,，同時(shí)摩爾消光系數(shù)變大,，顯色加深（圖4—2）。因而常用強(qiáng)酸如硫酸或鹽酸終止反應(yīng),。實(shí)際工作中,，用強(qiáng)酸尤其是鹽酸終止反應(yīng)后，顯色并不穩(wěn)定,，常隨時(shí)間增長(zhǎng)而顏色加深,，這是由于反應(yīng)后剩余的過氧化氫繼續(xù)氧化OPD而產(chǎn)生非酶催化的DAB的結(jié)果。有人在強(qiáng)酸反應(yīng)終止液中加入還原劑如亞硫酸鈉,，因還原劑可迅速*地將剩余的過氧化氫還原而阻止了OPD的非酶氧化,，結(jié)果顯色穩(wěn)定，數(shù)十小時(shí)內(nèi)不變,，而且無需避光,。OPD的缺點(diǎn)是其對(duì)機(jī)體具有致突變作用。由于OPD的不穩(wěn)定性,，現(xiàn)在的商品試劑盒中,，OPD均以片劑或粉劑供應(yīng)，臨用時(shí)再溶解于相應(yīng)的緩沖液,。

    在ELISA測(cè)定時(shí),，OPD色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：在0．1mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH5．0）中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H₂0₂,，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H₂0₂；②終止液：2 mol／L硫酸（含0．1 mol／L亞硫酸鈉）,；③測(cè)定波長(zhǎng)：492nm,。

    TMB是一種優(yōu)于OPD的新型HRP色原底物。其氧化產(chǎn)物聯(lián)苯醌在波長(zhǎng)450nm處有zui大消光系數(shù),，如果HRP量少,，過氧化氫溶液和TMB過量時(shí)，則形成藍(lán)色的陽(yáng)離子根,。降低pH,，即可使藍(lán)色的陽(yáng)離子根轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色的聯(lián)苯醌（圖4—3）。使用硫酸作為終止劑可使產(chǎn)物穩(wěn)定90min,，但隨后本底顯色就不斷加深,，國(guó)內(nèi)有人認(rèn)為使用1％SDS作為終止劑，可使鮮藍(lán)色24h內(nèi)保持不變,，陰陽(yáng)性對(duì)比十分明顯,，但在我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)1％SDS對(duì)上述顯色有較強(qiáng)的褪色作用，目前仍以硫酸作為終止劑較為理想,。ELISA中,，底物反應(yīng)顯色后，常選擇其具zui大吸收的波長(zhǎng)450nm比色測(cè)定結(jié)果,。而’Madersbacher和Berger等為提高以TMB作底物的ELISA測(cè)定的敏感性,，選擇顯色呈指數(shù)加深時(shí)的波長(zhǎng)405nm比色測(cè)定。他們首先測(cè)定一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品在450nm和405nm的值,，證實(shí)A450nm／A405nm之比為3．2,，然后在使用波長(zhǎng)405nm測(cè)定含低濃度待測(cè)物的標(biāo)本得到的OD值再乘以常數(shù)3．2，即為待測(cè)標(biāo)本在波長(zhǎng)450nm處的真值,。該種雙波長(zhǎng)測(cè)定方法可使ELISA測(cè)定范圍提高3倍,。TMB的顯色反應(yīng)雖與OPD一樣同屬氧化還原反應(yīng)，但前者的反應(yīng)是可逆的,，如終止液中存在還原劑（維生素C及亞硫酸鈉,、SDS等），則可反應(yīng)顯色迅速消退,。TMB雖然溶解度相對(duì)較低,，但由于其高檢測(cè)敏感性及無致突變作用，現(xiàn)已基本上取代了OPD而成為HRPzui為常的色原底物,。

    在商品ELISA試劑盒尤其是國(guó)內(nèi)的產(chǎn)品中,，TMB色原底物常為已配好的A及B兩種液態(tài)試劑，其中一種是含一定濃度過氧化氫的溶液，一種為TMB溶液,，鑒于過氧化氫,、TMB在溶液中相對(duì)不穩(wěn)定的特點(diǎn)，因此,，我們?cè)谑褂?/span>ELISA試劑盒時(shí),，如發(fā)現(xiàn)底物A和（或）B出現(xiàn)顏色，或二者各取一滴混合后顯色,，說明該試劑盒的底物溶液已變質(zhì)或已受污染，必須廢棄,。

    在ELISA測(cè)定時(shí),，TMB色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將TMB以0．1 mol／L的濃度溶于二甲亞砜，然后,，再將其以1 mmol／L和H₂0₂以3．0 mmol／L的濃度溶于0．2mol／L醋酸鈉／枸櫞酸緩沖液（pH4．0），即可應(yīng)用。②終止液：2 mol／L硫酸,。③測(cè)定波長(zhǎng)：450nm,。

    ABTS也是HRP的一種高靈敏底物。在H：O：存在下,，ABTS的氨鹽轉(zhuǎn)變?yōu)橐装l(fā)生歧化的陽(yáng)離子根（圖4—4）,。陽(yáng)離子根為綠色，與OPD的黃色氧化產(chǎn)物相比更適于可見光測(cè)定（測(cè)定波長(zhǎng)入＝414nm）,。上述顯色也不穩(wěn)定,，10 mmol／L疊氮鈉是較為理想的終止劑，可使顯色穩(wěn)定數(shù)十小時(shí),，且可減少陽(yáng)離子根的歧化,。另有人報(bào)道用1．25％NaF終止反應(yīng)效果較好。

    ABTS在目前國(guó)內(nèi)的ELISA試劑盒中基本上沒有應(yīng)用,，但在國(guó)外ELISA試劑盒偶見有應(yīng)用,。

    在ELISA測(cè)定時(shí)，ABTS色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：先將ABTS以2 mmol／L和H₂0₂以2．5 mmo!／L的濃度溶于0．1 mol／L醋酸鹽緩沖液（pH 4．2）,，即可應(yīng)用,；②終止液：10 mmol／L疊氮鈉；③測(cè)定波長(zhǎng),；414nm或405nm,。

    除上述三種外，HRP的氧化還原底物尚有O-dianisidine（ODA）,，5—氨基水楊酸（5—AS）以及dicarboxindine等,。

    （二）氧化耦聯(lián)色原底物對(duì)

HRP的氧化耦聯(lián)色原底物對(duì)主要有4—氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對(duì)（Trinder試劑）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦聯(lián)底物對(duì)（Ngo—Lenhoff試劑）等。

    在H₂0₂存在下,，4—氨基安替比林和苯酚經(jīng)HRP作用縮合形成紅色的醌亞胺,，其在入＝492 nm處有zui大吸收（圖4—5）。

    該耦聯(lián)色原底物對(duì)用于固相ELISA時(shí),，敏感性一般較低,，反應(yīng)見光不穩(wěn)定，而且苯酚易發(fā)生多聚化,，缺乏適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)終止劑,。因此，該試劑常限于葡萄糖,、三酰甘油,、肌酸激酶等臨床生化指標(biāo)的酶法檢測(cè)應(yīng)用。1989年日本學(xué)者用其作為色原底物建立了一種以HRP作標(biāo)記酶的均相酶免疫試驗(yàn),，可用甲醛終止反應(yīng),。但這種方法僅停留在實(shí)驗(yàn)室階段，其后也未見有其他實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用報(bào)道,，可能還有其固有的缺陷,。

    4—氨基安替比林：苯酚耦聯(lián)底物對(duì)色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將4—氨基安替比林以2 mmol／L，苯酚以25 mmol／L和H₂0₂以0．8 mmol／L的濃度溶于0．1 mol／L磷酸鹽緩沖液（pH7．2）,，即可應(yīng)用,；②終止液：未見報(bào)道；③測(cè)定波長(zhǎng)：492nm,。

    MBTH和DMA在HRP的作用下縮合生成紫藍(lán)色的吲達(dá)胺（indamine）,，zui大吸收波長(zhǎng)為590nm，見光不穩(wěn)定,。用鹽酸或硫酸終止反應(yīng)后,，pH應(yīng)為3．0左右，pH值的降低使顯色從紫藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榍逦乃{(lán)色,，zui大吸收波長(zhǎng)從590nm變?yōu)?/span>595nm,，然而pH值的進(jìn)一步降低，將導(dǎo)致光吸收消失,。

    MBTH：DMA耦聯(lián)對(duì)在固相ELISA測(cè)定幾乎沒有應(yīng)用,。

堿性磷酸酶（AP）

    在ELISA測(cè)定中，堿性磷酸酶的色原底物zui常用的是對(duì)硝基苯磷酸鹽（p-nitropheny—

|phosate,，pNPP）,。pNPP在堿性磷酸酶的作用下生成對(duì)硝基酚（pNP），其在入＝405 nm處有zui大吸收.

    由于堿性條件下pNP的光吸收增強(qiáng),，并可使堿性磷酸酶失活,，因而可使用碳酸鈉作為終止劑,。二乙醇胺緩沖液中不能有單乙醇胺，因?yàn)閱我掖及穼?duì)堿性磷酸酶有溫度依賴的抑制作用,。較高濃度的無機(jī)磷可競(jìng)爭(zhēng)性地抑制堿性磷酸酶的活性,，pNPP貯存時(shí)間過長(zhǎng)由于非酶水解而產(chǎn)生硝基酚和磷酸鹽時(shí)即可出現(xiàn)這種情況，此時(shí)pNPP呈黃色,。

    因此,，用于ELISA測(cè)定時(shí)，pNPP必須五色,。pNP的摩爾消光系數(shù)（光吸收）的變化取決于溶液的pH及溫度,、離子強(qiáng)度、蛋白含量,，當(dāng)溫度從15~C升高至45℃時(shí),，pNP在入＝405 nm處的光吸收將增加5％～7％。

    在ELISA測(cè)定時(shí),，pNPP色原底物的具體配方為①顯色底物溶液：將pNPP以10 mmol／L的濃度溶于含1 mmol／LMgCl：的0．1 mol／L二乙醇胺緩沖液（pH 9．8），即可應(yīng)用,；②終止液：0．5 mol／L碳酸鈉,；③測(cè)定波長(zhǎng)：405nm。

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