ELISPOT 技術(shù)簡介

　　隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學及生物學領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用 , 使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破,。在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ ELISA ）檢測體液中游離的細胞因子（ CK ）或抗體,，但由于游離的循環(huán)抗體或 CK 的半哀期不同,，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合,，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及 CK 的水平,。 80 年代,，國外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理,，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ ELISPOT ）,。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用,，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義,。

　　ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統(tǒng) ELISA 法,，是定量 ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展,。兩者都是檢測細胞產(chǎn)生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們zui大的不同在于：

n         ELISA 通過顯色反應(yīng),，在酶標儀上測定吸光度,，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。

n         ELISPOT 也是通過顯色反應(yīng),，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點,，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過 CTL 公司的 ELISPOT 分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)， 1 個斑點代表 1 個細胞,，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率,。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）

n         由于是單細胞水平檢測,， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏,，能從 20 萬 -30 萬細胞中檢出 1 個分泌該蛋白的細胞。

n         捕獲抗體為高親和力,、高特異性,、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時,，不會影響活化細胞分泌細胞因子,。

　　ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術(shù)原理與ELISA相似。其實驗設(shè)計是在96微孔培養(yǎng)盤底部披覆PVDF薄膜,，用來吸附特殊挑選,、且無毒性（不含sodium azide、內(nèi)毒素endotoxin）的單株抗體,。靜脈血PBMC細胞經(jīng)適當分離處理后,，會被分配到微孔盤上，再接受適當?shù)目乖碳?，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養(yǎng)一段時間,。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數(shù)小時后會開始分泌細胞激素,，此時局部（在緊靠分泌細胞的周圍）分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲,。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素（Biotin）標記的二次抗體來標志,，其后再以結(jié)合酵素的StreptAvidin與之作用,，并加入酵素受質(zhì)使其呈色，有反應(yīng)作用的細胞會留下染色斑點,。

ELISPOT 檢測原理 

　　細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子,，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后,， 被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結(jié)合,，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結(jié)合。 BCIP/NBT 底物孵育后,， PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子,，通過 CTL 公司生產(chǎn)的 ELISPOT 酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。

ELISPOT 分析儀的出現(xiàn)解決了以下問題 

n         哪些斑點是抗原特異性 T 細胞產(chǎn)生的（此斑點具有進一步分析價值）,，哪些是無關(guān)細胞產(chǎn)生的（此斑點沒有 T 細胞研究價值）

n         斑點大小的意義

n         在對不同細胞因子計數(shù)和分析時，如何定義斑點zui大和zui小尺寸

n         如何從單個細胞基礎(chǔ)上分析

n         實驗度有多高,？如果一個細胞產(chǎn)生相似的細胞因子,，在多大程度上會干擾分析結(jié)果？

n         幾次重復(fù)實驗才能使結(jié)果更有意義,？

ELISPOT 斑點的判讀

　　像多數(shù)的Cell-based分析技術(shù)一樣,，ELISPOT Cytokine技術(shù)也是相當耗時、耗勞力的工作,。事實上到目前為止,，以目視法判讀少量細胞族群的特性如激活T細胞之激素分泌，仍被視為是免疫學技術(shù)上的一大挑戰(zhàn),。ELISPOT結(jié)果的判讀常需要專聘,、有經(jīng)驗的技術(shù)員才可以；有時就算有專職技師判讀，使用傳統(tǒng)的顯微鏡計算斑點數(shù)仍不免會偶有主觀意見,，而有所偏頗,。

　　科學實證的本質(zhì)，在于如何使實驗結(jié)果能盡可能客觀,、,、同時有高重現(xiàn)性，傳統(tǒng)的人工計算法顯然無法達到此一要求,。故而有幾個科研團隊使自行開發(fā)Plate Scanner與自動分析軟件,，其中以Paul Lehmann教授研究開發(fā)之ImmunoSpot? Analyzer自動分析儀代表性。分析ELISPOT實驗數(shù)據(jù)的過程中,，儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像,，而后儲存成TIF檔；這些影像可以進一步使用手動,、或是自動方式計算斑點數(shù)目,，如果使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設(shè)定條件,，然后同時分析斑點的大小,，以推估激素分泌的多寡。預(yù)料像ImmunoSpot? Analyzer這一類自動圖像掃描分析儀器,，將可克服傳統(tǒng)顯微鏡判讀方法耗費人力,、及人為客觀性等缺點，*解除ELISPOT分析技術(shù)的瓶頸問題,，進一步推廣該技術(shù)的新穎應(yīng)用,。

　　ImmunoSpot@影像掃描分析儀可以提供不同的數(shù)據(jù)格式，包括未處理與處理過的膜表面影像,、每個小孔中的斑點數(shù)目,、每個小孔中的平均斑點數(shù)目、每個小孔中斑點大小的直方統(tǒng)計圖,。

ELISPOT技術(shù)的過去

　　ELISPOT是20多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù),。Czerkinsky 等人在1983年，運用該技術(shù)成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細胞頻率,。從那時起世界各國免疫學者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術(shù)競賽,，每個團隊都希望能將此一技術(shù)推廣來研究T細胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內(nèi)實驗的環(huán)境,，藉由偵測T細胞分泌的各類細胞因子,，來定量機體內(nèi)免疫反應(yīng)啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預(yù)測體內(nèi)免疫系統(tǒng)即將進行的下游免疫反應(yīng),。

　　ELISPOT Cytokine技術(shù)雖說操作簡單,，但該技術(shù)并沒能如預(yù)期地很快地被成功應(yīng)用在ex vivo T細胞功能研究,。要讓ELISPOT技術(shù)從B細胞免疫走向T細胞免疫的產(chǎn)生的*個主要問題，便是靈敏度的提升,，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產(chǎn)量極少,。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質(zhì),、呈色底膜的材質(zhì)等幾個技術(shù)性的問題,，使當時多數(shù)研究團隊很難獲得清晰的斑點，結(jié)果是敏感度不夠,、數(shù)據(jù)分析重現(xiàn)性低,。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應(yīng)用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術(shù)因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失,。與原來的標準膜面相比,，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜,，讓呈色斑點集中,、清晰、對比色高,，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度,。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統(tǒng)標準薄膜（Panel B）并行實驗的比較結(jié)果。同樣的人體 PBMC樣品,，在通過*相同的實驗,，Panel A呈現(xiàn)較清晰的小色點。

　　第二個技術(shù)性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設(shè)缺乏科學實證,，也使得該技術(shù)在當時并沒受到該有的廣泛重視,。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎(chǔ)但很重要的問題，諸如,； 　　

n         實驗所得的斑點是抗原特定T細胞所生產(chǎn),，還是旁觀細胞受Cytokine刺激的次級效應(yīng)？

n         斑點的小或大有何生理意義,；如何決定cutoff值,？

n         能否相信斑點是由單一的細胞造成？

n         ELISPOT Cytokine分析技術(shù)能準確測量的頻率范圍,？

n         如果效應(yīng)相互拮抗的cytokine同時產(chǎn)生，它們是否會互相妨礙,？及到什么程度,？

ELISPOT 技術(shù)的現(xiàn)在

　　1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術(shù)改良,，ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達到科研人員的期待,，它已是當世*zui靈敏抗原特定T細胞的體外檢測技術(shù),。藉由檢驗新鮮分離PBMC細胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術(shù)可提示T細胞免疫系統(tǒng)的兩個重要參數(shù)：抗原特定T細胞的clone族群大??；和免疫效應(yīng)細胞的信號傳導路徑Th1/Th2。

　　多年來經(jīng)過數(shù)十個研究團隊的致力研究,，對于ELISPOT分析技術(shù)本身的幾個問題,，也有了科學上的驗證。目前一般*,，ELISPOT技術(shù)允許科研人員在單細胞水平上識別抗原特定T細胞,，主要針對經(jīng)由CD4或者CD8細胞的免疫反應(yīng)。在適當?shù)膶嶒炘O(shè)計下,，ELISPOT Cytokine 斑點的數(shù)量分析顯示斑點是由一個單細胞所生成,，同時斑點形態(tài)學與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細胞族群的產(chǎn)能。也因為如此,，ELISPOT是個免疫學上的標竿技術(shù),，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細胞實際分泌Cytokine的進程,，進而可以得到藥理學信息,，闡明免疫調(diào)節(jié)藥物如何影響T細胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉(zhuǎn),；使能分泌Cytokine的Precursor T細胞族群變小,，或減少每Precursor T細胞的cytokine產(chǎn)能，而ELISPOT技術(shù)能提供雙份信息,。

　　ELISPOT分析技術(shù)的幾個特點已經(jīng)讓它在抗原特定T細胞免疫學上*,。此技術(shù)是當世*準許百萬分之一1:1000,000的準確分析，如此強效的解析力使流式細胞技術(shù)也望其項背,，以目前國內(nèi)外常規(guī)的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色,，流式技術(shù)的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細胞免疫學研究是必須的,，因為抗原特定T細胞一般在機體周邊循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生的頻率通常低于萬中取一,。此外由于ELISPOT Cytokine技術(shù)被證實適用于冰凍后復(fù)蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當?shù)男r,，沒有喪失功能,。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前,、后的病人血樣,，如果試驗牽涉全國多個臨床試驗機構(gòu)，病人血樣可冰存并同時集中在「*實驗室」一齊被測試,。同理,，一個血樣或標準對照品可被分裝小份,，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對,，同時有利LISPOT Cytokine技術(shù)流程的規(guī)范化,、標準化。

ELISPOT 未來展望

　　據(jù)筆者的觀察,，ELISPOT 分析技術(shù)正在歐美各國發(fā)揮它的完整潛能,，它讓免疫學家可以直接洞察活體內(nèi)T細胞相關(guān)生理學或病理學，就像是心臟外科醫(yī)師手上的那張心電圖,，經(jīng)由這個技術(shù)科研人員可以在活體內(nèi)直接進入一個器官系統(tǒng),，在那里視察、發(fā)掘,，得到全新的智識,。

　　從各國文獻可見ELISPOT技術(shù)已經(jīng)達到標準化、規(guī)范化的要求,，并被廣泛地應(yīng)用在多項領(lǐng)域,，包括監(jiān)視癌癥病人接受免疫療程時的反應(yīng)（Lewis, 2000 and Janetzki, 2000），以及感染性疾病（Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000）,、腫瘤（Nagorsen, 2000）,、或自體免疫病人體內(nèi)的一個特定的免疫反應(yīng)型式（Pelfrey, 2000）。ELISPOT技術(shù)同時也在數(shù)個疫苗效價評估人體試驗中,，被當成重要的終結(jié)指針,。2003年1月，世界衛(wèi)生組織通過與大陸北京性艾中心合作,，將應(yīng)用ELISPOT技術(shù)來監(jiān)測HIV疫苗研究免疫應(yīng)答反應(yīng)技術(shù),，該計劃將是利用ELISPOT技術(shù)對亞洲國家從事HIV疫苗研究和臨床試驗的有關(guān)研究。我們期待未來此一技術(shù)能在我國免疫學界得到廣泛地應(yīng)用,。

其它ELISPOT應(yīng)用范圍

n         移植研究 – allograft rejection

n         疫苗開發(fā) -亦可評估疫苗效力,，或是疫苗注射路徑影響

n         Th0/Th1/Th2細胞轉(zhuǎn)換分析

n         自體免疫研究 – 免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究

n         癌癥研究 -腫瘤反應(yīng)T細胞作用

n         過敏機制探討 – IL-4誘導免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機制之細胞激素研究

n         傳染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等

n         抗原決定位定圖

n         體液免疫力研究 – B細胞免疫球蛋白及特定亞型反應(yīng)的進展研究

目前 CTL 公司使用 ImmunoSpot 的部分研究領(lǐng)域如下

n         單細胞解析度/體外抗原特異性 T 細胞頻率的準確測量

n         測量 1 類和 2 類免疫力

n         T 細胞的同源性細胞因子產(chǎn)物與旁細胞因子產(chǎn)物

n         功能性 T 細胞親和力的測量

n         細胞因子協(xié)同表達 / 雙色 ELISPOT

n         斑點尺寸分布

n         PBMC的體外測量的分析到分析的重可生產(chǎn)性

n         新鮮和低溫儲藏后的人類PBMC的比較

n         CD 8+ T 細胞和CD8+ T 細胞和 Granzyme B 的 ELISPOT 分析

n         除了人類 PBMC ,、鼠淋巴結(jié)/脾臟細胞以外的細胞的 ELISPOT 分析

n         免疫與佐藥

n         腫瘤免疫

n         移植免疫

ELISPOT 技術(shù)優(yōu)勢 

ELISPOT 分析使單細胞分泌產(chǎn)物可視化,。這些分析異常敏感，因為它是在直接在分泌細胞的周圍進行捕捉,，而且是在表面被沖淡,，或者被臨近的細胞上的受體捕獲，或降解之前,。

zui低至1：100萬細胞精度的活體外頻率測量,。這種分辨率已經(jīng)遠遠超過使用細胞內(nèi)細胞因子的四聚物染色和 ELISA 法測量的精度。這種高敏感度是非常關(guān)鍵的,，因為抗原特異性 T 細胞在體外都是典型性的低頻率,。

高產(chǎn)量 T 細胞分析成為可行。一個經(jīng)過訓練的相關(guān)實驗室小組可以測試成百的樣本中幾十種抗原的反應(yīng),。

只需要少量細胞,，就可以用于通其他細胞學分析方法進行比較。例如,，45毫升的血液就足以用于測試600種不同抗原/肽類物質(zhì)的反應(yīng),。

可以定義CD4和CD8細胞的免疫因子指標。這是因為只需要少數(shù)細胞,，分析就可以在高產(chǎn)量模式下進行,。ELISPOT 分析在篩選肽庫，繪制免疫因子方面是一個理想的工具,。

用于確定抗原特異性 T 細胞的功能性親和力,。這zui大可能受到肽類藥物刺激至50%的影響。

可以用于研究未經(jīng)藥物處理過的細胞的分泌過程,。如果觀察到凈產(chǎn)量減少,，可以確定這種區(qū)別是來自于分泌細胞的減少，還是每個細胞分泌產(chǎn)量的減少,。

淋巴細胞在 ELISPOT 分析后依然存活,。這使得分析之后進行增值，用于更進一步的分析,、克隆或者低溫儲藏成為可能,。

低溫儲藏后的人類淋巴細胞可以用于檢測，而不會丟失其功能,。治療前和治療后的樣本可以并排進行測試,，結(jié)果可以重復(fù)。

選擇 CTL 的原因

　　我們是 ELISPOT 技術(shù)的世界

　　我們了當代細胞因子 ELISPOT 協(xié)議

　　我們將圖像分析引入 ELISPOT

　　我們制造了*臺商業(yè) ELISPOT 分析儀

　　我們將細胞因子 ELISPOT 分析提升到了科學

　　我們是 NIH 免疫耐受網(wǎng) ELISPOT 分析的實驗室

　　我們是 BD 公司* ELISPOT 分析儀

　　我們專注于 ELISPOT 技術(shù)并極大拓展了其應(yīng)用領(lǐng)域

　　我們是*能提供整體 ELISPOT 方案的技術(shù)提供商

　　    基礎(chǔ)研究

　　    臨床免疫監(jiān)控

　　    全套軟件和硬件解決方案

　　    全套符合 GLP 規(guī)范的 ELISPOT 實驗室建設(shè)服務(wù)

　　    全面技術(shù)咨詢服務(wù)

　　    全面的基礎(chǔ)和臨床技術(shù)合作服務(wù)

　　我們是*能提供全套 ELISPOT 質(zhì)量控制的服務(wù)商

　　過去 15 年中,，我們專注于 ELISPOT 研究,，取得了巨大的成功。今后我們將一如既往地與客戶一起,，全力推動 ELISPOT 的技術(shù)發(fā)展和進步,。我們不僅提供 ELISPOT 全套技術(shù)解決方案，更看重并全力協(xié)助客戶掌握 ELISPOT 實驗技術(shù),。

　　敬請聯(lián)絡(luò)我們,，讓我們?yōu)槟氖聵I(yè)助上一臂之力！

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