人血小板衍生生長因子（PDGF）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供體外研究使用

預期應用

ELISA法定量測定人血清、血漿,、細胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生物液體中血小板衍生生長因子（PDGF）含量,。

實驗原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗PDGF抗體的微孔中依次加入標本或標準品,、生物素化的抗PDGF抗體、HRP標記的親和素,，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的PDGF呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為20 ng/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋

20 ng/ml,，10 ng/ml，5 ng/ml,，2.5 ng/ml,，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml,，0.312 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。

如配制10 ng/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）20 ng/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul）,，實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻,，在使用前一小時內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A,。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.         濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。

10.     終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）。

標本的采集及保存

1.         血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。

2.         血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑,，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。

3.         細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測,，或?qū)吮痉庞?/span>-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。

注：以上標本置4℃保存應小于1周,，-20℃或-80℃均應密封保存,，-20℃不應超過3個月，-80℃不應超過6個月,；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測；高血脂的標本不需進行特殊處理,，可直接檢測,。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?；試劑或樣品稀釋時,，均需混勻，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線,。如樣品濃度過高時,，均應用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍,。建議各實驗室在操作前*行預實驗以建立*稀釋倍數(shù)。

1.         加樣：分別設空白孔,、標準孔,、待測樣品孔?？瞻卓?/span>加樣品稀釋液100ul,，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜,，37℃反應120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液,。

2.         棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘,。

3.         溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板3次,，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃,，60分鐘,。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）,。

7.         依序每孔加終止溶液50ul,，終止反應，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后立即進行檢測。

注：

1.         每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔（不同于空白孔）,，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶液及2N H₂SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。

2.         嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑,。

3.         洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果,。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應盡快進行下步操作,，避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài)。

4.         消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。

5.         在儲存和溫育時避免強光直接照射。

6.         未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，請配置標準品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10ul）,，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,；檢測液A、B,，以及底物溶液在使用前,，應置于37℃溫育30分鐘；請勿重復使用已稀釋過的標準品,、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。

7.         建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性,。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙,，酶標板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需

要,，重復此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中,。

特異性

    本試劑盒可同時檢測重組或天然的人血小板衍生生長因子（PDGF），且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應,。

計算

  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標）,，OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線（推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如curve expert 1.3）,，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1.         洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。

2.         一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣,。

3.         請每次測定的同時做標準曲線，做復孔,。

4.         如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定,，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.         在配制標準品,、檢測溶液工作液時,，請以相應的稀釋液配制，不能混淆,。

6.         底物請避光保存,。

檢測范圍：0.312 ng/ml - 20 ng/ml

zui低檢測限：0.078 ng/ml

說明

1.          在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染,，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。

2.          小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本 / 標準品,，酶結(jié)合物或底物時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的 “預孵育”時間,，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。而且,，洗滌不充分將影響試驗結(jié)果,。

3.          試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標簽上的標示為準,。

4.          濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。

5.          剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì),，此為正常現(xiàn)象,，不會對實驗結(jié)果造成任何影響,。

6.          中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。

7.          所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。

8,、有效期：6個月

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