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                         人白三烯人白三烯E4（LTE4）酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

                         人人白三烯白三烯            酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

                                 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

                                 試劑盒使用說(shuō)明書(shū)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品編號(hào)：：CSB-E05176h

產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品編號(hào)：：

檢測(cè)范圍檢測(cè)范圍：：12.5 ng/ml - 800 ng/ml

檢測(cè)范圍檢測(cè)范圍：：

zui低檢測(cè)限zui低檢測(cè)限：：3 ng/ml

zui低檢測(cè)限zui低檢測(cè)限：：

特異性特異性：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的：               人LTE4,，且與其他相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng),。

特異性特異性：：

有效期有效期：：6 個(gè)月

有效期有效期：：

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：ELISA 法定量測(cè)定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中LTE4 含量,。

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：

說(shuō)明說(shuō)明

說(shuō)明說(shuō)明

    1．試劑盒保存：-20℃（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）,；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

    2．濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。

    3．中、英文說(shuō)明書(shū)可能會(huì)有不一致之處,，請(qǐng)以英文說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn),。

    4．剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造

       成任何影響。

實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理

    用純化的抗體包被微孔板,，制成固相載體,，往包被抗LTE4 抗體的微孔中依次加入標(biāo)本

或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗LTE4 抗體,、HRP 標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物TMB 顯

色,。TMB  在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的

深淺和樣品中的LTE4 呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度 （OD 值），計(jì)算樣

品濃度,。

試劑盒試劑盒組成及試劑配制組成及試劑配制

試劑盒試劑盒組成及試劑配制組成及試劑配制

1.  酶聯(lián)板酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96 孔）,。

    酶聯(lián)板酶聯(lián)板

2.  標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品 （Standard）：2 瓶（凍干品）。

    標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品

3.  樣品稀釋液樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶,。

    樣品稀釋液樣品稀釋液

4.  生物素標(biāo)記抗體稀釋液生物素標(biāo)記抗體稀釋液（（Biotin-antibody Diluent）：）1×10ml/瓶,。

    生物素標(biāo)記抗體稀釋液生物素標(biāo)記抗體稀釋液（（                     ））

5.  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （（HRP-avidin Diluent）：）1×10ml/瓶。

    辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （（                 ））

6.  生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體（（Biotin-antibody）：）1×120μl/瓶（1：100）

    生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體（（              ））

7.  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 （（HRP-avidin）：）1×120μl/瓶（1：100）

    辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素 （（          ））

8.  底物溶液底物溶液 （（TMB Substrate）：）1×10ml/瓶,。

    底物溶液底物溶液 （（             ））

9.  濃洗滌液濃洗滌液 （（Wash Buffer）：）1×20ml/瓶,，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

    濃洗滌液濃洗滌液 （（          ））

10. 終止液終止液（（Stop Solution）：）1×10ml/瓶（2N H  SO4）,。

    終止液終止液（（            ））                2

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.  高速離心機(jī)

3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭,，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器

6.  蒸餾水,，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存

1.  血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2 小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g 離心20 分鐘,，取上清即可

    檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

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2.  血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g 離心15

    分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g 離心20  分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放

    于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：注：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè),。。

注注：：標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,，,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。,。

標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

首先通過(guò)文獻(xiàn)檢索的方式了解待測(cè)樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)

曲線(xiàn)的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的,。稀釋的過(guò)程中,，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度

時(shí),，稀釋了“N”倍,，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：2 瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10 分鐘以上,，

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：

然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為800 ng/ml，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋800 ng/ml,，

400 ng/ml,，200 ng/ml，100 ng/ml,，50 ng/ml,，25 ng/ml，12.5 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)

準(zhǔn)濃度0 ng/ml,，臨用前15 分鐘內(nèi)配制。

如配制400 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml       （不要少于0.5ml）800 ng/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml

樣品稀釋液的Eppendorf 管中,，混勻即可,，其余濃度以此類(lèi)推。

生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則的稀釋原則：：

生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則的稀釋原則：：

臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制

 （每孔100μl）,，實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl 生物素標(biāo)記抗體加990μl 生物素標(biāo)

記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻,，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則的稀釋原則：：

辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則的稀釋原則：：

臨用前以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋?zhuān)♂屒案鶕?jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的

總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10μl 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和

素加990μl  辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)

配制,。

操作步驟操作步驟

操作步驟操作步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí),，均需混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡,。

每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如樣品濃度過(guò)高時(shí),，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)允箻悠贩显?/p>

劑盒的檢測(cè)范圍,。

1.  加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測(cè)樣品孔,。空白孔加樣品稀釋液100μl,，余孔分別加

    標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl,，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸

    及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，37℃反應(yīng)120 分鐘,。

    為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2.  棄去液體,，甩干，不用洗滌,。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl                         （取1μl 生物素標(biāo)記

    抗體加99μl 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）,，

    37℃,60 分鐘,。

3.  溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3 次,，每次浸泡1-2 分鐘,，200μl/每孔，甩

    干,。

4.  每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液 （同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl,，37℃，

    60 分鐘,。

5.  溫育60 分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5 次,，每次浸泡1-2 分鐘,，200μl/每孔，甩

    干,。

6.  依序每孔加底物溶液90μl,，37℃避光顯色 （（30  分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4

                                        （（

    孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4 孔顯色不明顯,，即可終止）。

7.  依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加入順序應(yīng)盡量

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    與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入

    終止液,。

8.  用酶聯(lián)儀在450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度 （OD 值）。 在加終止液后15 分鐘以?xún)?nèi)

    進(jìn)行檢測(cè),。

注：注

注注

1.  用戶(hù)在初次使用試劑盒時(shí),，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底,。

2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔,，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H  SO4,。

                                                                        2

   測(cè)量時(shí)先用此孔調(diào)OD 值至零,。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,。

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過(guò)

   氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用,。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)

    品,、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液,。

5.  建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定,，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法洗板方法

洗板方法洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,，

酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi),，浸泡1-2 分鐘,。根據(jù)需

要,，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,。

計(jì)算計(jì)算

計(jì)算計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪

出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物

的濃度與OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的直線(xiàn)回歸方程式,，將樣品的OD 值代入方程式，計(jì)算出樣

品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)

注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)

1.  當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡,。

2. 洗滌過(guò)程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性,。

3. 一次加樣時(shí)間控制在5 分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣,。

4. 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),，做復(fù)孔。

5.  如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高,，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

6.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液工作液時(shí),，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆,。

7.  底物請(qǐng)避光保存,。

8.  不要用其它生產(chǎn)廠(chǎng)家的試劑替換試劑盒中的試劑。