人γ干擾素（IFN-γ）elisa試劑盒

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         Human Interferon γ （IFN-γ）

                             ELISA Kit

                         Catalog No. CSB-E04577h

                                       （96T）

    This immunoassay kit allows for the in vitro quantitative determination of human IFN-γ

    concentrations in cell culture supernates, serum, plasma and other biological fluids.

    Expiration date    six months from the date of manufacture

    FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.

                            CUSABIO BIOTECH CO., Ltd.

                   http://www.cusabio.com/  http://www.cusabio.cn/

                  : [email protected]  [email protected]

                                          1

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INTRODUCTION

Interferon-gamma （IFN-γ） is a dimerized soluble cytokine that is the only member

of    the   type    II  class    of  interferons.     This    interferon     was    originally    called

macrophage-activating           factor.   The   IFN-γ  monomer         consists    of  a   core   of  six

α-helices   and   an   extended   unfolded   sequence   in   the   C-terminal   region.   This   is

shown in the structural models below. The α-helices in the core of the structure are

numbered 1 to 6. Full length IFN-γ is 143 amino acids in length, the models are

126   amino   acids   in   length.   Affinity   for   the   glycosaminoglycan   heparan   sulfate

resides    solely    within   the   deleted    sequence     of  17   amino     acids.   In  contrast   to

interferon-α and interferon-β which can be expressed by all cells, IFN-γ is secreted

by   Th1    cells,   Tc   cells,   dendritic   cells   and   NK   cells.   Also   known    as   immune

interferon,   IFN-γ  is   the   only   Type   II   interferon.   It   is   serologically   distinct   from

Type I interferons and it is acid-labile, while the type I variants are acid-stable.

IFN-γ  has       antiviral,   immunoregulatory,         and    anti-tumour      properties.    It  alters

transcription in up to 30 genes producing  a variety  of physiological   and cellular

responses. Amongst the effects are: Increase antigen presentation of macrophages.

Activate      and   increase    lysosome      activity   in   macrophages.       Suppress     Th2    cell

activity.   Cause   normal   cells   to   increase   expression   of   class   I   MHC   molecules.

Promotes adhesion and binding required for leukocyte migration Promotes NK cell

activity.   Activation   by   IFN-γ is   achieved   by  its   interaction   with   a   heterodimeric

receptor   consisting   of   IFNGR1   &   IFNGR2   （interferon  gamma   receptors）.   IFN-γ

binding     to  the   receptor    activates   the   JAK-STAT        pathway.     In   addition,   IFN-γ

activates APCs and promotes Th1 differentiation by upregulating the transcription

factor   T-bet.    IFN-γ  is    the   hallmark    cytokine   of   Th1    cells   （whereas    Th2    cells

produce IL-4 and Th17 cells produce IL-17）. NK cells and CD8+ cytotoxic T cells

also   produce   IFN-γ.   IFN-γ suppresses   osteoclast   formation   by  rapidly  degrading

the   RANK   adaptor   protein   TRAF6            in   the   RANK-RANKL   signaling            pathway,

which otherwise stimulates the production of NFκB.

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PRINCIPLE OF THE ASSAY

The   microtiter   plate   provided   in   this   kit   has   been  pre-coated   with   an   antibody

specific    to  IFN-γ.   Standards    or  samples    are  then  added    to  the  appropriate

microtiter   plate   wells   with   a   biotin-conjugated   polyclonal   antibody   preparation

specific   for   IFN-γ  and   Avidin   conjugated   to   Horseradish   Peroxidase   （HRP）   is

added     to   each   microplate    well   and    incubated.    Then    a  TMB      （3,3'5,  5'

tetramethyl-benzidine） substrate solution is added to each well. Only those wells

that contain IFN-γ, biotin-conjugated antibody and enzyme-conjugated Avidin will

exhibit   a   change   in   color.   The   enzyme-substrate   reaction   is   terminated   by   the

addition    of   a  sulphuric    acid  solution    and   the  color   change    is  measured

spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm ± 2 nm. The concentration of

IFN-γ in the samples is then determined by comparing the O.D. of the samples to

the standard curve.

DETECTION RANGE

0.78 ng/ml-50 ng/ml. The standard curve concentrations used for the ELISA’s were

50 ng/ml, 25 ng/ml, 12.5 ng/ml, 6.25 ng/ml, 3.12 ng/ml, 1.56 ng/ml, 0.78 ng/ml.

SPECIFICITY

This    assay  recognizes    recombinant     and  natural   human    IFN-γ.   No   significant

cross-reactivity or interference was observed.

SENSITIVITY

The minimum detectable dose of human IFN-γ is typically less than 0.195 ng/ml.

The sensitivity of this assay, or Lower Limit of Detection （LLD） was defined as

the lowest protein concentration that could be differentiated from zero.

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MATERIALS PROVIDED

               Reagent                                         Quantity

               Assay plate                                          1

                Standard                                            2

                Sample Diluent                                 1 x 20 ml

               Biotin-antibody Diluent                         1 x 10 ml

               HRP-avidin Diluent                              1 x 10 ml

               Biotin-antibody                                 1 x 120l

               HRP-avidin                                      1 x 120l

                                                               1 x 20 ml

               Wash Buffer

                                                             （25×concentrate）

               TMB Substrate                                   1 x 10 ml

                Stop Solution                                  1 x 10 ml

STORAGE

1.  Unopened test kits should be stored at 2-8°C upon receipt and the microtiter

    plate should be kept in a sealed bag with desiccants to minimize exposure to

    damp air. The test kit may be used throughout the expiration date of the kit.

    Refer to the package label for the expiration date.

2.  Opened test kits will remain stable until the expiring date shown, provided it is

    stored as prescribed above.

3.  A  microtiter   plate   reader   with   a   bandwidth   of   10   nm   or   less   and   an   optical

    density range of 0-3 OD or greater at 450nm wavelength is acceptable for use

    in absorbance measurement.

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REAGENT PREPARATION

Bring all reagents to room temperature before use.

1.   Wash   Buffer       If   crystals   have   formed   in   the   concentrate,   warm   to   room

     temperature     and   mix   gently   until  the  crystals  have  compley     dissolved.

     Dilute 20 ml of Wash Buffer Concentrate into deionized or distilled water to

     prepare 500 ml of Wash Buffer.

2.   Standard        Reconstitute the  Standard with 1.0 ml of  Sample Diluent. This

     reconstitution produces a stock solution of 50 ng/ml. Allow the standard to sit

     for   a   minimum   of   15   minutes   with   gentle   agitation   prior   to   making   serial

     dilutions. The undiluted standard serves as the high standard （50 ng/ml）. The

     Sample Diluent serves as the zero standard （0 ng/ml）.

3.   Biotin-antibody        Dilute   to   the   working   concentration   specified   on   the   vial

     label using Biotin-antibody Diluent（1:100）, respectively.

4.   HRP-avidin         Dilute to the working concentration specified on the vial label

     using HRP-avidin Diluent（1:100）, respectively.

Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear

               eye, hand, face, and clothing protection when using this material.

OTHER SUPPLIES REQUIRED

     Microplate     reader   capable   of  measuring     absorbance    at  450   nm,   with  the

     correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.

     Pipettes and pipette tips.

     Deionized or distilled water.

     Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.

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SAMPLE COLLECTION AND STORAGE

     Cell Culture Supernates           Remove particulates by centrifugation and assay

     immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid repeated

     freeze-thaw cycles.

     Serum      Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot for 30

     minutes before centrifugation for 15 minutes at 1000 x g. Remove serum and

     assay   immediay   or   aliquot   and   store   samples   at   -20°   C.   Avoid   repeated

     freeze-thaw cycles.

     Plasma      Collect plasma using citrate, EDTA, or heparin as an anticoagulant.

     Centrifuge for 15 minutes at 1000 x g within 30 minutes of collection. Assay

     immediay or aliquot and store samples at -20° C. Avoid repeated

     freeze-thaw cycles.

Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.

ASSAY PROCEDURE

Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is

recommended that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate.

1.   Add 100l of Standard, Blank, or Sample per well. Cover with the adhesive

     strip. Incubate for 2 hours at 37° C.

2.   Remove the liquid of each well, don’t wash.

3.   Add 100l of Biotin-antibody working solution to each well. Incubate for 1

     hour at 37°C. Biotin-antibody working solution may appear cloudy. Warm to

     room temperature and mix gently until solution appears uniform.

4.   Aspirate each well and wash, repeating the process three times for a total of

     three   washes.   Wash   by   filling   each   well   with   Wash   Buffer   （200l）   using   a

     squirt    bottle,  multi-channel     pipette,   manifold     dispenser    or  autowasher.

     Complete   removal   of   liquid   at   each   step   is   essential   to   good   performance.

     After   the   last   wash,   remove   any   remaining   Wash   Buffer   by   aspirating   or

     decanting. Invert the plate and blot it against clean paper towels.

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5.   Add 100l of HRP-avidin working solution to each well. Cover the microtiter

     plate with a new adhesive strip. Incubate for 1 hour at 37° C.

6.   Repeat the aspiration and wash three times as step 4.

7.   Add 90l of TMB Substrate to each well. Incubate for 30 minutes at 37°C.

     Keeping the plate away from drafts and other temperature fluctuations in the

     dark.

8.   Add   50l   of  Stop   Solution   to   each   well.   If   color   change   does   not   appear

     uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.

9.   Determine      the  optical   density   of  each   well   within   30   minutes,    using   a

     microplate reader set to 450 nm.

CALCULATION OF RESULTS

Average the duplicate readings for each standard, control, and sample and subtract

the average zero standard optical density. Create a standard curve by reducing the

data using computer software capable of generating a four parameter logistic （4-PL）

curve-fit.   As   an  alternative,   construct   a  standard   curve    by  plotting   the  mean

absorbance for each standard on the y-axis against the concentration on the x-axis

and   draw   a   best   fit   curve   through   the   points   on   the   graph.   The   data   may   be

linearized by plotting the log of the IFN-γ concentrations versus the log of the O.D.

and the best fit line can be determined by regression analysis. This procedure will

produce an adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted,

the concentration read from the standard curve must be multiplied by the dilution

factor.

LIMITATIONS OF THE PROCEDURE

     The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.

     Do not mix or substitute reagents with those from other lots or sources.

     It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard curve be

     consistent with the samples being assayed.

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     If samples generate values higher than the highest standard, dilute the samples

     with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.

     Any   variation     in  Standard   Diluent,    operator,   pipetting   technique,   washing

     technique, incubation time or temperature, and kit age can cause variation in

     binding.

     This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors, binding

     proteins, and other factors present in biological samples. Until all factors have

     been   tested   in   the   Quantikine   Immunoassay,   the   possibility   of   interference

     cannot be excluded.

TECHNICAL HINTS

     When mixing or reconstituting protein solutions, always avoid foaming.

     To avoid cross-contamination, change pipette tips between additions of each

     standard level, between sample additions, and between reagent additions. Also,

     use separate reservoirs for each reagent.

     When      using  an   automated    plate   washer,   adding    a   30  second   soak   period

     following  the   addition   of   wash   buffer,   and/or   rotating  the   plate   180   degrees

     between wash steps may improve assay precision.

     To ensure accurate results, proper adhesion of plate sealers during incubation

     steps is necessary.

     Substrate   Solution   should   remain   colorless   until   added   to   the   plate.   Keep

     Substrate     Solution   protected    from   light.  Substrate  Solution     should   change

     from colorless to gradations of blue.

     Stop Solution should be added to the plate in the same order as the Substrate

     Solution. The color developed in the wells will turn from blue to yellow upon

     addition of the Stop Solution. Wells that are green in color indicate that the

     Stop Solution has not mixed thoroughly with the Substrate Solution.

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                 人人γ干擾素干擾素（IFN-γ）酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

                 人人 干擾素干擾素                酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

                              試劑盒說明書試劑盒說明書

                              試劑盒說明書試劑盒說明書

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

產(chǎn)品編號產(chǎn)品編號：：CSB-E04577h

產(chǎn)品編號產(chǎn)品編號：：

檢測范圍檢測范圍：：0.78 ng/ml - 50 ng/ml

檢測范圍檢測范圍：：

zui低檢測限zui低檢測限：：0.195 ng/ml

zui低檢測限zui低檢測限：：

特異性特異性：：本試劑盒可同時(shí)檢測天然或重組的人IFN-γ，且與其他相關(guān)蛋白無

特異性特異性：：

交叉反應(yīng),。

有效期有效期：：6 個月

有效期有效期：：

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：ELISA       法定量測定人血清,、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清或其它相關(guān)生

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：

物液體中IFN-γ含量,。

說明說明：：

說說明明：：

1.  試劑盒保存：-20℃（較長時(shí)間不用時(shí)）,；2-8℃（頻繁使用時(shí)）。

2.  濃洗滌液低溫保存會有鹽析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,。

3.  中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準(zhǔn),。

4.  剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實(shí)

    驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。

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概述概述：：

概述概述：：

     干擾素 （IFN）是1957 年被發(fā)現(xiàn)的,。它是一類分泌性蛋白,，具有廣譜抗

病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能,。根據(jù)產(chǎn)生干擾素細(xì)胞來源不同,、理化性質(zhì)和

生物學(xué)活性的差異，可分為α-1b 型干擾素,、β-干擾素和γ干擾素,。γ干擾素

 （IFN-γ）也叫Ⅱ型IFN，主要由活化T 細(xì)胞產(chǎn)生,，活化NK 細(xì)胞也可產(chǎn)生IFN-γ,。

人IFN-γ基因定位于12 號染色體，在DNA 水平上IFN-γ基因與IFN-α/β基因

無同源性,。人IFN-γ 成熟分子由143 個氨基酸組成,，糖蛋白，以同源雙體形

式存在,，分子量為40kDa ,。IFN-γ 的生物學(xué)作用有較嚴(yán)格的種屬特異性，人

IFN-γ只作用于人或靈長類動物的細(xì)胞,。其生物學(xué)作用有：（1）誘導(dǎo)單核細(xì)胞,、

巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞,、皮膚成纖維細(xì)胞,、血管內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞等MHC Ⅱ

類抗原的表達(dá),，使其參與抗原提呈和特異性免疫的識別過程,。此外，IFN-γ可

上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1（CD54）表達(dá),，促進(jìn)巨噬細(xì)胞FcγR 表達(dá),，協(xié)同誘導(dǎo)TNF

并促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷病原微生物。（2）促進(jìn)LPS                          體外刺激小鼠B           細(xì)胞分泌

IgG2a,，降低IgG1,、IgG2b、IgG3 和IgE  的產(chǎn)生,；抑制由IL-4 誘導(dǎo)的小鼠B

細(xì)胞增殖,，IgG1 和IgE 產(chǎn)生以及FcεR Ⅱ表達(dá)；促進(jìn)SAC 誘導(dǎo)的人B 細(xì)胞的

增殖,。（3）協(xié)同IL-2 誘導(dǎo)LAK 活性,，促進(jìn)T 細(xì)胞IL-2R 表達(dá)。（4）誘導(dǎo)急性期

蛋白合成,，誘導(dǎo)髓樣細(xì)胞分化,。

實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理：：

實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理：：

     用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗IFN-γ 抗體的微孔

中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗IFN-γ抗體、HRP 標(biāo)記的親和素,，

經(jīng)過*洗滌后用底物TMB 顯色,。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，

并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的IFN-γ呈正相關(guān),。

用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度 （OD 值），計(jì)算樣品濃度,。

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試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制：：

試劑盒組成及試劑配制試劑盒組成及試劑配制：：

1.  酶聯(lián)板酶聯(lián)板（Assay plate ）：                                      一塊（96 孔）,。

    酶聯(lián)板酶聯(lián)板

2.  標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：                                          2 瓶（凍干品）,。

    標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品

3.  樣品稀釋液樣品稀釋液（Sample Diluent）：                                  1×20ml/瓶。

    樣品稀釋液樣品稀釋液

4.  生物素標(biāo)記抗體稀釋液生物素標(biāo)記抗體稀釋液（（Biotin-antibody Diluent）：）             1×10ml/瓶,。

    生物素標(biāo)記抗體稀釋液生物素標(biāo)記抗體稀釋液（（                          ））

5.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（（HRP-avidin Diluent）：） 1×10ml/瓶,。

    辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液（（                        ））

6.  生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體（（Biotin-antibody）：）                  1×120l/瓶（1：100）。

    生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體（（                 ））

7.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（（HRP-avidin ）：）            1×120l/瓶（1：100）,。

    辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素（（               ））

8.  底物溶液底物溶液（（TMB Substrate）：）                                   1×10ml/瓶,。

    底物溶液底物溶液（（                 ））

9.  濃洗滌液濃洗滌液（（Wash Buffer ）：） 1×20ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25 倍,。

    濃洗滌液濃洗滌液（（              ））

10.  終止液終止液（（Stop Solution）：）                        1×10ml/瓶（2N H  SO4）,。

    終止液終止液（（              ））                                         2

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材：：

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材：：

1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.  高速離心機(jī)

3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時(shí),，用多通道移液器

6.  蒸餾水,，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存：：

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存：：

1.  血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2 小時(shí)或4℃過夜后于1000   x   g 離心20 分

    鐘，取上清即可檢測,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍

    融。

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2.  血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑,，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2   -   8°   C

    1000 x g 離心15 分鐘,，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍

    融,。

3.  細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000   x   g 離心20 分鐘,，取上清即可檢

    測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

注：注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測,。。

注注：：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果,，,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。,。

標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量,，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。

只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi),，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的,。稀釋的過程中，應(yīng)

做好詳細(xì)的記錄。zui后計(jì)算濃度時(shí),，稀釋了“N”倍,，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：

2 瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10 分鐘以上，然后

反復(fù)顛倒/搓動以助溶解,，其濃度為50   ng/ml,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋

50 ng/ml,，25 ng/ml，12.5 ng/ml,，6.25 ng/ml,，3.12 ng/ml，1.56 ng/ml,，0.78 ng/ml,，

樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15 分鐘內(nèi)配制,。

如配制25   ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml           （不要少于0.5ml）50   ng/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)品

加入含0.5ml 樣品稀釋液的Eppendorf 管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。

生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：：

生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則：：

臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所

需的總量配制（每孔100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如10l 生物素

標(biāo)記抗體加990l          生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前

一小時(shí)內(nèi)配制,。

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辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：：

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：：

臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的

每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制 （每孔100l），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml,。如

10l  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加 990l                     辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋

液的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。

操作步驟操作步驟：：

操作步驟操作步驟：：

實(shí)驗(yàn)開始前,，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí),，均需混勻,，混勻

時(shí)盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí),，用樣品

稀釋液進(jìn)行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.  加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔,、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00l,，

    余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100l，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于

    酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，

    37℃反應(yīng)120 分鐘。

    為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,。

2.  棄去液體，甩干,，不用洗滌,。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100l （取1l

    生物素標(biāo)記抗體加99l  生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻,，

    在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）,，37℃,60 分鐘。

3.  溫育60 分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體,，甩干，洗板3 次,，每次浸泡1-2 分鐘,，

    200l/每孔，甩干,。

4.  每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液 （同生物素標(biāo)記抗體工作液）

    100l,，37℃，60 分鐘,。

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5.  溫育60 分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5 次,，每次浸泡1-2 分鐘,，

    200l/每孔，甩干,。

6.  依序每孔加底物溶液90l,，37℃避光顯色 （（30  分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)

                                                （（

    準(zhǔn)品的前3-4 孔有明顯的梯度藍(lán)色,，后3-4 孔梯度不明顯,，即可終止）。

7.  依序每孔加終止溶液50l,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。終止液的加

    入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,，底

    物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。

8.  用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。在加終止液后

    15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測,。

實(shí)驗(yàn)備注實(shí)驗(yàn)備注

實(shí)驗(yàn)備注實(shí)驗(yàn)備注

1.  用戶在初次使用試劑盒時(shí),，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘,，以便試劑集中到

    管底,。

2.  每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑,，只是zui后加底物溶

    液及2N H  SO4,。測量時(shí)先用此孔調(diào)OD 值至零。

              2

3.  為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi),，酶標(biāo)板加上

    蓋或覆膜。

4.  未使用完的酶標(biāo)板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體

    工作液,、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用,。請

    勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液,、或辣根過氧化物

    酶標(biāo)記親和素工作液,。

5.  建議檢測樣品時(shí)均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

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洗板方法洗板方法：：

洗板方法洗板方法：：

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺上

鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml

注入孔內(nèi),，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次,。

 自動洗板：如果有自動洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。

計(jì)算計(jì)算：：

計(jì)算計(jì)算：：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）,，OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)）,，在半對

數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD  值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；

再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD  值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方

程式，將樣品的OD  值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即

為樣品的實(shí)際濃度,。

注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：：

注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)：：

1.  當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩,，避免起泡。

2.  洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。

3.  一次加樣時(shí)間控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。

4.  請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。

5.  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計(jì)算時(shí)請zui后乘以稀釋

    倍數(shù),。

6.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測溶液工作液時(shí)，請以相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆,。

7.  底物請避光保存。

8.  不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑,。

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Notes

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