PCR擴(kuò)增后一般進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,電泳后一般有以下幾種條帶:
1,、引物帶,。引物濃度過(guò)高或是擴(kuò)增效率不是特別高時(shí)都會(huì)有,一般不呈現(xiàn)為細(xì)帶,,為發(fā)散狀,;如果目的擴(kuò)增產(chǎn)物帶和引物帶都很亮,可以考慮適當(dāng)降低引物量,。
2,、引物二聚體帶。比引物跑得慢一點(diǎn),,條帶清晰,,但如果擴(kuò)增產(chǎn)物小于100bp時(shí),產(chǎn)物與引物二聚體就不好分別了,,建議采用DNA聚丙烯酰胺電泳(不是蛋白質(zhì)的SDS聚丙烯酰胺電泳),;如果引物二聚體在優(yōu)化復(fù)性溫度后仍然嚴(yán)重影響目的產(chǎn)物的擴(kuò)增,優(yōu)先考慮更換引物設(shè)計(jì)(因?yàn)橐锖铣傻某杀颈确磸?fù)優(yōu)化條件的成本低)
3,、目的擴(kuò)增產(chǎn)物帶,。其大小與設(shè)計(jì)大小相同,,條帶清晰。
4,、非特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶,。其大小與設(shè)計(jì)大小不相同,條帶清晰,。一般考慮通過(guò)提高復(fù)性溫度來(lái)減少或消除(也可用溫度梯度功能來(lái)尋找*的復(fù)性溫度,,東勝龍811型PCR儀就有此功能)。如果其片段大小比目的片段大較多,,可以通過(guò)減少延伸時(shí)間來(lái)減少或消除(即不給它足夠的延伸時(shí)間),。還有一種非特異擴(kuò)增產(chǎn)物帶是來(lái)自于逆轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)的基因組DNA的污染,如果目的擴(kuò)增產(chǎn)物中有內(nèi)含子,,擴(kuò)增產(chǎn)物很可能大于目的基因,。這種條帶通過(guò)優(yōu)化復(fù)性溫度是不能消除的,可以在逆轉(zhuǎn)錄前用無(wú)RNA酶的DNA酶進(jìn)行樣本處理,。
5,、模板DNA帶。模板濃度過(guò)高時(shí)可能出現(xiàn),。如果是基因組DNA為模板,,條帶可能會(huì)很亂且較大。一般進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),,模板濃度都不要太大,,否則會(huì)產(chǎn)生一些比目的基因長(zhǎng)一點(diǎn)的雜質(zhì)DNA(可能不成條帶,也看不到),,這是由PCR擴(kuò)增原理造成的,。
(空格分隔,最多3個(gè),單個(gè)標(biāo)簽最多10個(gè)字符)
立即詢價(jià)
您提交后,,專屬客服將第一時(shí)間為您服務(wù)