實驗原理
帶電荷的蛋白質(zhì)，在電場中向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動稱為電泳,。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點不同,，但大都在pH7以下，若將血清置于pH8.6的緩沖液中，則這些蛋白質(zhì)均帶負(fù)電,，在電場中都向陽極移動,。由于各種蛋白質(zhì)在同一pH環(huán)境中所帶負(fù)電荷多少及分子大小不同，所以在電場中向陽極泳動速度也不同,。蛋白質(zhì)分子小而帶電荷多者,，泳動速度快;反之，則泳動速度慢,。因此可將血清蛋白質(zhì)依次分為清蛋白,、a1-球蛋白、a2-球蛋白,、b-球蛋白和g球蛋白五條區(qū)帶,，經(jīng)染色可計算出各血清蛋白質(zhì)含量的百分?jǐn)?shù)。
以醋酸纖維薄膜(CAM)為支持介質(zhì),，電泳分離后經(jīng)染色處理,，可展示出清晰的蛋白質(zhì)電泳圖譜。由于染色時染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合與蛋白質(zhì)的量成正比,，因此將各蛋白質(zhì)帶剪下,，分別用一定量的NaOH稀溶液洗脫下來,，即可進(jìn)行比色,，測定出各蛋白質(zhì)區(qū)帶的相對含量。也可用一定量的有機(jī)溶劑使CAM溶解制成透明膜而用光密度計進(jìn)行掃描定量,。
醋酸纖維薄膜電泳具有微量,、快速、簡便及分辨率較高等優(yōu)點,，廣泛應(yīng)用于血清蛋白,、血紅蛋白、脂蛋白,、同工酶的分離和測定,。
實驗試劑
1.巴比妥—巴比妥鈉緩沖液(pH8.6，m=0.06),。稱取巴比妥2.21克和巴比妥鈉12.36克,，溶于500毫升蒸餾水中，加熱溶解,。待冷至室溫后,，再加蒸餾水稀釋至1000毫升。
2.染色液
(1)麗春紅S染色液：稱取麗春紅S O.4g,、三氯醋酸6g,，用蒸溜水溶解并稀釋至100ml。
(2)氨基黑10B染色液：稱取氨基黑(C22H13O12N6S3Na3)10B 0.1g,溶于20ml無水乙醇中，加冰醋酸5ml,使其溶解,。另取磺基水楊酸2.5g,，溶于少量的蒸餾水中，加入前液將兩液混合搖勻,，再以蒸餾水補(bǔ)足至100ml,。稱取麗春紅S0.4克及三氯醋酸6克;用蒸餾水溶解，并稀釋至100毫升,。
3.漂洗液,。
(1)3%(V/V)醋酸溶液：適用于麗春紅S染色的漂洗。
(2)甲醇45ml,、冰醋酸5ml,、蒸餾水50ml混勻，適用于氨基黑10B染色的漂洗,。
4.透明液 取無水乙醇75毫升和冰醋酸25毫升混勻備用,。
5. 洗脫液
(1)0.1mol/L NaOH溶液：用于麗春紅S染色的洗脫。
(2)0.4mol/L NaOH溶液：用于氨基黑10B染色的洗脫,。
6.40%(V/V)醋酸溶液,。
實驗設(shè)備 電泳儀、電泳槽,、分光光度計或光密度儀,。
實驗材料 醋酸纖維薄膜、培養(yǎng)皿,、濾紙,、鑷子、點樣器,、直尺,、鉛筆、剪刀等,。
實驗步驟
1,、電泳槽的準(zhǔn)備
將巴比妥-巴比妥鈉緩沖液加入電泳槽中(兩側(cè)槽內(nèi)注入等量的緩沖液)，調(diào)節(jié)兩側(cè)內(nèi)的緩沖液,，使其在同一水平面,，液面與支架的距離約為2～2.5cm。支架寬度到恰好適合CAM的長度,，用3～4層濾紙或4層紗布搭橋,。
2、CAM準(zhǔn)備
取醋纖薄膜(2厘米*8厘米)在CAM的無光澤面(涂有醋酸纖維素)距一端1.5cm處用直尺和鉛筆輕劃一線(與CAM的長軸垂直),，作點樣標(biāo)記,，將膜條編號后將無光澤面朝下浸入巴比妥-巴比妥鈉緩沖液中，待充分浸透后取出(一般約需求20～30min)，夾于潔凈的濾紙中,吸去多余的緩沖液.
3,、點樣
用血清加樣器將3-5ul無溶血的新鮮血清均勻地點在劃線處,，樣品應(yīng)與膜的邊緣保持一定距離，以免電泳圖譜中的蛋白區(qū)帶變形,。待血清滲入膜后移開點樣器,。點樣應(yīng)注意，要適量,、均勻和垂直,，并避免弄破薄膜。
4,、平衡
將已點樣的薄膜加樣面朝下,，點樣端置于陰，將膜條緊貼于電泳槽支架的鹽橋上并保持平直,，橋的另一端垂入緩沖液中,，鹽橋?qū)⒛さ膬啥伺c緩沖液連通，加上槽蓋平衡5min后通電電泳,。
5,、電泳
正確聯(lián)接電泳槽與整流器對應(yīng)的正負(fù)極，點樣側(cè)接負(fù)極,，另一側(cè)接正極,。開啟電源通電。調(diào)節(jié)電壓10V～15V/cm膜長,電流0.4～0.6mA/cm膜總寬,，電泳40-60分鐘(通常夏季需45min,冬季需60min),，待電泳區(qū)帶展開3.5cm～4cm時即可關(guān)閉電源,。
6,、染色
通電完畢，立即取出薄膜直接浸入麗春紅S或氨基黑10B染色液中,，染色5～10分鐘,。
7、漂洗
至少準(zhǔn)備3～4個漂洗皿,，裝入漂洗液,。從染色液中取出薄膜條并盡量瀝去染色液，按順序投入漂洗液中反復(fù)漂洗,，直至背景漂白為止,。此時清晰可見5條色帶。待干,。
8,、定量
(1)洗脫比色法 取六支試管，分別標(biāo)明“A、α1,、α2,、β、γ,、空白",。將漂洗凈的薄膜剪下各區(qū)帶放入相應(yīng)的試管內(nèi)，另從空白背景剪一塊平均大小的膜條置于空白管中,，根據(jù)染色不同按以下方法洗脫,。
①氨基黑10B染色洗脫：6支試管于清蛋白管內(nèi)加入0.4mmol/L NaOH溶液6ml,其余5管各加3ml，振搖數(shù)次,，置37℃水浴20分鐘,，使色澤*浸出。用620nm波長,，以空白管調(diào)零,，讀取各管的吸光度，其中清蛋白管吸光度×2,。
②麗春紅S染色洗脫：洗脫液用0.1mmol/L氫氧化鈉溶液,，加入量同上。10分鐘后,，于清蛋白管內(nèi)加入40%(V/V)醋酸0.6ml,，其余5管各加入0.3ml，以中和部分氫氧化鈉,，使溶液色澤加深,。如出現(xiàn)沉淀，可離心取上清液比色,。用520nm波長,，以空白管調(diào)零，讀取各管的吸光度,，其中清蛋白管吸光度×2,。
(2)光密度掃描法
① 透明：將已漂凈吹干的CAM條浸入透明液中3～5分鐘，取出平鋪于潔凈干燥玻片上(應(yīng)無氣泡),，直立片刻除去過多的透明液,。于90～100℃烘箱內(nèi)烘烤5～10分鐘，取出冷卻至室溫,。此法透明的CAM,，各蛋白區(qū)帶鮮明，薄膜平整,，可直接掃描或作*保存,。若用十萘氫或液體石醋透明,，應(yīng)將漂洗過的薄膜烘干后進(jìn)行透明，透吸后的薄膜不能久藏,，易發(fā)生皺折,。
② 掃描定量：將已透明的薄膜放入全自動光密度計或其它光密度掃描的光路，選擇波長520nm,，描記各蛋白區(qū)帶峰,，并計算各蛋白成分的相對含量。
9,、計算
定量計算時,，先計算各光密度值的總和：再計算血清各部分蛋白質(zhì)所占的百分率
吸光度總和(T)=2A+α1+α2+β+γ(吸光度)
血清各蛋白組分的相對百分?jǐn)?shù)=Ax/AT×100%
Ax表示各球蛋白組分 (2A+α1+α2+β+γ)的吸光度。
A%=2A/ T×100% β=β/ T×100%
α1%=α1/ T×100% γ%=γ/ T×100% α2%=α2/ T×100%
各組分蛋白質(zhì)含量(g/L)=(各組分蛋白百分?jǐn)?shù)(%)×血清總蛋白g/L)/100
10,、臨床意義
(1)血清蛋白醋纖薄膜電泳的正常參考值為：
蛋白質(zhì)組分 g/L 占總蛋白百分比(%)
白蛋白 35～52 57.0～68.0
α1球蛋白 1.0～4.0 1.0～5.7
α2球蛋白 4.0～8.0 4.9～11.2
β球蛋白 5.0～10.0 7.0～13.0
γ球蛋白 6.0～13.0 9.8～18.2
(2)臨床意義
電泳圖譜可為臨床疾病診斷提供依據(jù),。
腎病型可見于急慢性腎炎、腎病綜合征,、腎功能衰竭等,，圖型表現(xiàn)為Alb降低，α2和β升高;肝硬化型可見于慢性活動性肝炎,、肝硬變等,，圖型表現(xiàn)為Alb降低，β和γ增高,，可出現(xiàn)β與γ難以分離而連接在一起的“β-γ"橋,，此現(xiàn)象是由于肝臟纖維增生導(dǎo)致IgA增高所致;急性反應(yīng)時相型常以α1、α2增高為特征;慢性炎癥型則以Alb降低,，α2,、γ增高較為常見;M蛋白血癥主要見于多發(fā)性骨髓瘤，病人有大量單克隆蛋白質(zhì)(主要是IgG或IgA),，電泳時可在β和βγ之間出現(xiàn)一條峰形狹窄的區(qū)帶,，稱M區(qū)帶。
注意事項
1.通電時,，不得接觸槽內(nèi)的緩沖液或CAM,，以防觸電,。
2.每次電泳時應(yīng)交換電極以使兩側(cè)電泳槽內(nèi)緩沖液的正負(fù)離子相互交換,，以使緩沖液的PH維持在一定水平。
3.電泳緩沖液的液面要保持一定的高度,，過低可能會出現(xiàn)γ球蛋白的電滲現(xiàn)象(γ球蛋白向陰極移動),，同時電泳槽兩側(cè)的液面應(yīng)保持在同一水平，否則,，通過薄膜時有虹吸現(xiàn)象,，將會影響蛋白質(zhì)分子的泳動速度,。
4.電泳失敗或圖譜不理想的常見原因
(1)電泳圖譜不整齊或蛋白各組分分不佳：點樣過多;點樣不均勻、不整齊;薄膜過濕,，樣品擴(kuò)散;點樣速度太慢,，薄膜表面局部干燥或薄膜未*浸透或溫度過高致使膜面局部干燥或水分蒸發(fā);緩沖液變質(zhì);電泳時薄膜放置不正，歪斜,、彎曲,，與電流方向不平行;樣品不新鮮;電流過低;CAM質(zhì)量不好，薄膜結(jié)構(gòu)過分細(xì)密,，透水性差,，導(dǎo)電差等。
(2)染色后白蛋白中間著色淺：染色時間不夠或染色液陳舊;白蛋白含量過高,，可減少血清用量或延長染色時間,。
(3)電泳速度慢：電流過低;供給薄膜的緩沖液不足，連接薄膜與緩沖液的濾紙或紗布過薄;溫度過低;薄膜結(jié)構(gòu)過分細(xì)密,，透水性差,，導(dǎo)電差;緩沖液水分蒸發(fā)，致使離子強(qiáng)度增大,。
(4)薄膜透明不*：透明液陳舊;浸泡時間不足;烘箱溫度未到90℃即把薄膜放入,。
5.染料問題：各種染料對血清各組分有不同的親和力，大多數(shù)染料對白蛋白的親和力大于球蛋白,。如氨基黑10B對球蛋白的結(jié)合力為白蛋白的80%,，因此常導(dǎo)致白蛋白結(jié)果偏高，球蛋白偏低,。用麗春紅S染色,，效果優(yōu)于氨基黑10B。麗紅是一種指示劑,，PH<10時呈紅色,，PH>12.5時呈紫色。在酸性溶液中它的zui大吸收峰在523nm左右,，呈對稱性,。在血清蛋白正常濃度范圍內(nèi)，麗春紅S能與各蛋白質(zhì)組分成正比例結(jié)合,，而氨基黑10B則對白蛋白染色過深,，區(qū)帶中容易出現(xiàn)著色不全的小點，不夠理想,。
6.樣品要求點在粗糙面(無光澤面),，否則樣品很難吸入膜內(nèi)。電泳時將點有樣品的一面朝下,，以防電泳過程中水分蒸發(fā),，影響電泳結(jié)果,。
7.標(biāo)本應(yīng)新鮮，不得溶血,。溶血標(biāo)本會使β球蛋白假性升高,，因血紅蛋白電泳位置在β球蛋白區(qū)域內(nèi)。
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