電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子,,如氨基酸,、多肽、蛋白質(zhì),、核苷酸,、核酸等都具有可電離基團(tuán),它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負(fù)電,,在電場的作用下,,這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下,,由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小,、形狀等性質(zhì)的差異,,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而對樣品進(jìn)行分離,、鑒定或提純的技術(shù),。
電泳過程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。Tiselius等在1937年進(jìn)行的自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì),,所以擴(kuò)散和對流都比較強(qiáng),,影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳,,樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過程,,減少了擴(kuò)散和對流等干擾作用。zui初的支持介質(zhì)是濾紙和醋酸纖維素膜,,目前這些介質(zhì)在實驗室已經(jīng)應(yīng)用得較少,。在很長一段時間里,小分子物質(zhì)如氨基酸,、多肽,、糖等通常用濾紙或纖維素,、硅膠薄層平板為介質(zhì)的電泳進(jìn)行分離,、分析,但目前則一般使用更靈敏的技術(shù)如HPLC等來進(jìn)行分析,。這些介質(zhì)適合于分離小分子物質(zhì),,操作簡單、方便,。但對于復(fù)雜的生物大分子則分離效果較差,。凝膠作為支持介質(zhì)的引入大大促進(jìn)了電泳技術(shù)的發(fā)展,使電泳技術(shù)成為分析蛋白質(zhì),、核酸等生物大分子的重要手段之一,。zui初使用的凝膠是淀粉凝膠,但目前使用得zui多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠,。蛋白質(zhì)電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠,。
電泳裝置主要包括兩個部分:電源和電泳槽。電源提供直流電,,在電泳槽中產(chǎn)生電場,,驅(qū)動帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類,。垂直板式電泳是較為常見的一種,,常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質(zhì)的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板,,玻璃板兩邊由塑料條隔開,,在玻璃平板中間制備電泳凝膠,,凝膠的大小通常是12cm 14 cm,厚度為1mm~2? mm,,近年來新研制的電泳槽,,膠面更小、更薄,,以節(jié)省試劑和縮短電泳時間,。制膠時在凝膠溶液中放一個塑料梳子,在膠聚合后移去,,形成上樣品的凹槽,。水平式電泳,凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上,,用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液,,或?qū)⒛z直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會引起帶電分子電荷的改變,,進(jìn)而影響其電泳遷移的速度,,所以電泳過程應(yīng)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行的,緩沖液可以保持待分離物的帶電性質(zhì)的穩(wěn)定,。
為了更好的了解帶電分子在電泳過程中是如何被分離的,,下面簡單介紹一下電泳的基本原理。在兩個平行電極上加一定的電壓(V),,就會在電極中間產(chǎn)生電場強(qiáng)度(E),,L是電極間距離。
在稀溶液中,,電場對帶電分子的作用力(F),,等于所帶凈電荷與電場強(qiáng)度的乘積。這個作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動,。在移動過程中,,分子會受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力(F’)的大小與分子大小,、形狀,、電泳介質(zhì)孔徑大小以及緩沖液粘度等有關(guān),并與帶電分子的移動速度成正比,,對于球狀分子,,F(xiàn)’的大小服從Stokes定律,即:F’=6πrηυ式中r是球狀分子的半徑,,η是緩沖液粘度,,υ是電泳速度(υ= d / t,單位時間粒子運(yùn)動的距離,cm / s ),。當(dāng)帶電分子勻速移動時: F = F’,,q?E = 6πrηυ由此可以看出,遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比,,與分子的大小和緩沖液的粘度成反比,。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量時,實際使用的是相對遷移率mR,。帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同,,因而在電泳過程中具有不同的遷移速度,形成了依次排列的不同區(qū)帶而被分開,。即使兩個分子具有相似的電荷,,如果它們的分子大小不同,由于它們所受的阻力不同,,因此遷移速度也不同,,在電泳過程中就可以被分離。有些類型的電泳幾乎*依賴于分子所帶的電荷不同進(jìn)行分離,,如等電聚焦電泳,;而有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產(chǎn)生的阻力不同而得到分離,如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,。分離后的樣品通過各種方法的染色,,或者如果樣品有放射性標(biāo)記,則可以通過放射性自顯影等方法進(jìn)行檢測,。
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