(一)材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎
分離提純某一種蛋白質(zhì)時(shí),，首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來并保持原來的天然狀態(tài),，不喪失活性。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎,。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有：
1. 機(jī)械破碎法
這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用,，使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有,，高速組織搗碎機(jī),、勻漿器、研缽等,。
2. 滲透破碎法
這種方法是在低滲條件使細(xì)胞溶脹而破碎,。
3. 反復(fù)凍融法
生物組織經(jīng)凍結(jié)后，細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破,。這種方法簡單方便,，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。
4. 超聲波法
使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎,。
5. 酶法
如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等,。
(二) 蛋白質(zhì)的抽提
通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液的pH,、離子強(qiáng)度,、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提,，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉,、tritonX-100等),，使膜結(jié)構(gòu)破壞，利于蛋白質(zhì)與膜分離,。在抽提過程中,，應(yīng)注意溫度，避免劇烈攪拌等,，以防止蛋白質(zhì)的變性,。
(三)蛋白質(zhì)粗制品的獲得
選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行的分離,。常用的有下列幾種方法：
1. 等電點(diǎn)沉淀法
不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同,，可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分離。
2. 鹽析法
不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同,，所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出,。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì)，并能再度溶解而不變性,。
3. 有機(jī)溶劑沉淀法
中性有機(jī)溶劑如乙醇,、丙酮，它們的介電常數(shù)比水低,。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,，進(jìn)而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質(zhì),。此外,，有機(jī)溶劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出,。由于有機(jī)溶劑會(huì)使蛋白質(zhì)變性,，使用該法時(shí)，要注意在低溫下操作,，選擇合適的有機(jī)溶劑濃度,。
(四)樣品的進(jìn)一步分離純化
用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì),，須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析,、離子交換纖維素層析,、親和層析等等。有時(shí)還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品,。
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