摘要：
化學發(fā)光免疫分析是將化學發(fā)光與免疫分析方法相結合,，綜合了化學發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性,，被廣泛應用到臨床檢測和藥物分析中。隨著新的發(fā)光試劑,，新固相材料的研制以及新標記技術應用,，化學發(fā)光免疫分析方法的靈敏度，重現(xiàn)性將大大提高,。
在分析化學中,，化學發(fā)光是當基態(tài)分子吸收化學反應中釋放的能量躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回到基態(tài)時產生的光,?；诨瘜W發(fā)光強度和被測物含量之間的關系建立的分析方法叫化學發(fā)光分析法，化學發(fā)光與液相色譜,、毛細管電泳,、免疫分析等技術的結合，具有靈敏度高,，線性范圍寬,，儀器簡單、操作簡便等特點,，已廣泛地應用于環(huán)境,、臨床、食品和工業(yè)分析中,。將化學發(fā)光與免疫分析方法相結合,，綜合了化學發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性，近年來,，成為研究的熱點,。
1化學發(fā)光免疫分析的分類
化學發(fā)光免疫分析根據(jù)發(fā)光體系應用于免疫分析中的方式不同可分為：直接標記發(fā)光物質的免疫分析、酶催化化學發(fā)光免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析,。
1．1直接標記發(fā)光物質的免疫分析
該方法是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體,。常用于標記的化學發(fā)光物質有吖啶酯類化合物，是有效的發(fā)光標記物,，其通過起動發(fā)光試劑的作用而發(fā)光,，強烈的直接發(fā)光在1S內完成，為快速的閃爍發(fā)光,。吖啶酯作為標記物用于免疫分析,，其化學反應簡單、快速、無需催化劑,；檢測小分子抗原采用競爭法,，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結合少,，本底低,；與大分子的結合不會減小所產生的光量，從而增加靈敏度,。張皓等采用直接化學發(fā)光技術進行的全自動雙抗夾心免疫測定方法,，對130例患者測定血清B—HCG含量法。用化學發(fā)光免疫分析法檢測．HCG,，操作簡便,、敏感度高、特異性強,，優(yōu)于一般的酶聯(lián)免疫法和放射免疫法,，適合于臨床實驗室推廣使用。
1．2酶催化化學發(fā)光免疫分析
從標記免疫分析角度,，酶催化化學發(fā)光免疫分析應屬酶免疫分析,，只是酶反應的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免疫分析*相同：以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免疫反應,，免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光,，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定,。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，它們有各自的發(fā)光底物,。辣根過氧化物酶常用的底物為魯米諾或其衍生物如異魯米諾,，魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，在過氧化物酶及活性氧(過氧化陰離子,、單線態(tài)氧,、羥自由基、過氧化氫)存在下,，生成激發(fā)態(tài)中間體,，當其回到基態(tài)時發(fā)光，其波長為425nln,。鈕心怡等采用特異性的兩株C．P單克隆抗體,，辣根過氧化物魯米諾酶促增敏化學發(fā)光體系，利用雙抗體夾心法檢測,。敏感度為0．102 g／L,；檢測線性范圍為0．102～20 L；多人次檢測證實試劑盒批內變異均小于10％，分析間變異小于15％,；與18 g／L人胰島素原,、2000mIU／L的人胰島素無顯著交叉反應。
堿性磷酸酶所用底物為環(huán)1,，2．二氧乙烷衍生物用于化學發(fā)光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩(wěn)定作用的基團——金剛烷基,，其分子中發(fā)光基團為芳香基團和酶作用的基團，在酶及起動發(fā)光試劑作用下引起化學發(fā)光,。馮艷銘等_3』采用雙抗體異位點一步夾心法,，以甲胎蛋白單克隆抗體作為固相包被，采用改良過碘酸鈉法進行甲胎蛋白多克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)制備酶標抗體,；以金剛烷胺衍生物CSPD作為底物,，優(yōu)化CSPD與SapphireII發(fā)光體系用國家標準品校定定量標準品，建立了人血清AFP的化學發(fā)光免疫定量分析法,。利用化學發(fā)光酶免疫分析方法,，以堿性磷酸酶作為標記物，環(huán)1,，2一二氧乙烷衍生物AMPPD為發(fā)光底物,，測定血清中的糖抗原50，檢出限為1．0umL～,，線性范圍為0～300umL一,。
批內精密度<7％，批內精密度為11％,。
1．3電化學發(fā)光免疫分析
電化學發(fā)光免疫分析的反應在電極表面進行,，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕，用另一反應物三丙胺來激發(fā)光反應,。在陽極表面,，這兩種物質可同時失去電子，發(fā)生氧化反應,。在電極板上二價的三聯(lián)吡啶釕迅速被氧化成三價三聯(lián)吡啶釕,，與此同時三丙胺也在電極板上被氧化成三丙胺陽離子自由基，三丙胺陽離子自由基自發(fā)地釋放一個質子而變成三丙胺非穩(wěn)定分子,，將一個電子遞給三價三聯(lián)吡啶釕,，形成激發(fā)態(tài)的二價三聯(lián)吡啶釕。激發(fā)態(tài)的二價三聯(lián)毗啶釕在衰減的同時發(fā)射一個波長為620／l／n的光子,，重新回到基態(tài)二價三聯(lián)吡啶釕,。這一過程在電極表面反復進行，產生,、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光,，并不斷增強,。張繼東用電化學發(fā)光免疫分析法在檢測乙肝標志物，發(fā)現(xiàn)用電化學方法檢測,，靈敏度更高,，專屬性更強。
2新進展
化學免疫分析方法的新進展主要表現(xiàn)在新的標記物以及標記技術的應用,，新型固相載體的應用以及聯(lián)用技術,。
2．1新的標記物
近年來，科學家們致力于化學發(fā)光物質的研究,，通過往發(fā)光體系中加入增加化學增強劑來增加量子產率以及發(fā)光時間,。同時一些學者將目光集中于新的標記發(fā)光物的開發(fā)中。并取得了相應成果,。目前已證明從棕櫚樹和大豆中提取的HRP的陰離子型同工酶(HRP2A)在沒有增強劑的情況下可以,、常時間催化luminol—H2O2體系發(fā)光，并且HRP．A比HRP—C穩(wěn)定性更好,，這在酶標記物的儲存中是非常重要的,。而白細胞堿性磷(Leukocyte Alkaline Phosphatase，LAP)與AIJP一樣,，也有催化性能,，并已用于化學發(fā)光的檢測。此外,，還通過合成技術合成了吖啶酯類化學發(fā)光試劑,。Zhuang等合成了一種新型雙吖啶化合物：1O，102二甲基23,，32二磺基29,，9'2二雙吖啶(DMDSBA)，并詳細研究了它的化學發(fā)光性質,。DMDSBA被用于標記抗一CEA抗體。標記的比率接近1．15～1．32,，平均標記比例是1．25,。結果表明，連接到抗一CEA抗體后,，標記抗體的免疫反應活性與DMDSBA的量子效率沒有明顯改變,。建立了一種新的夾心化學發(fā)光免疫方法，測定人血清中CEA的線性范圍為1．0～100ng／mL,，檢測限0．53ng／mL,。
2．2新標記技術的應用
固相標記方法的應用，減少游離標記物以及聚合蛋白質,；納米技術與生物分析的結合,，即利用Au、Ag等陽離子對化學發(fā)光具有催化放大作用，提高檢測靈敏度,。HonglanQ等利用電化學發(fā)光免疫分析方法,，將N．氨丁基一N．異魯米諾(ABEI)作為發(fā)光標記試劑標記在金毫微粒改性的石蠟活化的石墨電極上，測定人體[gG,。電化學發(fā)光的強度大大增強,，ABEI檢出限為2×10-14 mol／L(S／N=3)，lgG的檢出限為1×10,。g／mL(S／N=3),。線性范圍為3．0×10-ll～1．0×10-9g／mL。在濃度為1．0×10-10／mL時的RSD為3．1％,。說明金微?；瘜W發(fā)光的催化放大作用在化學發(fā)光免疫分析方法中有很大的應用前景。量子點(quantumdots,，QDs)又稱半導體納米微晶體,，是一種由Ⅱ．Ⅵ族或Ⅲ．V族元素組成的能夠接受激光產生熒光的半導體納米顆粒，直徑約為2～6nm,。與CLIA常用標記酶和熒光素相比,，QD不易失活，受外部環(huán)境影響小,，性質穩(wěn)定,，重現(xiàn)性好激發(fā)光譜范圍寬，而發(fā)射光譜窄且對稱,，是的標記物,。
2．3新固相材料的應用
新固相材料主要體現(xiàn)在(1)表面有與蛋白結合的官能團，可以充分固定抗體抗原,；(2)表面性質要保證不影響結合后蛋白的免疫反應活性,；(3)比表面積要足夠大以固定足夠量蛋白(4)應具有親水性以避免與待測物和樣品基質的非共價結合；(5)在載液的沖擊下保持表面的抗體結合活性,。目前用于丌．的固相材料主要有尼龍,、瓊脂糖凝膠、磁性粒子,，以及二氧化硅可控孔度玻璃(Controlled poreglass,，CPG)和玻璃微珠_IJ等有機硅材料。
2．4與其他技術聯(lián)用
目前研究zui多的是毛細管電泳一化學發(fā)光免疫分析技術(CECLIA)結合了CE對生物樣品分離的分離和CLIA的高靈敏度檢測,。王軍華等利用毛細管電泳免疫化學發(fā)光檢測鼠血管平滑肌細胞中zmol骨形成蛋白．2,，采用辣根過氧化物酶(HRP)催化魯米諾．過氧化氫，以對碘苯酚增強其化學發(fā)光反應,，HRP檢出限為4．4pmol／L(53zmo1),，是目前報道檢測HRP的zui高靈敏度之一,。用毛細管電泳化學發(fā)光免疫方法測定了人血清中乙肝表面抗原和抗體，并與酶免疫分析方法比較,，驗證了毛細管電泳化學發(fā)光免疫技術用于臨床的可行性,。流動注射化學發(fā)光免疫技術流動注射化學發(fā)光分析技術是將化學發(fā)光分析和流動注射相結合的一種高靈敏度的微量及痕量分析技術，其分析速度快,、器設備簡單,，是當前分析化學領域中研究的熱點。利用順序流動注射技術分析非離子型表面活性劑,，線性范圍0～1000ppb,，zui低檢出限為10ppm每個樣品的分析時問為15min，已經(jīng)被成功用于河水中anti-ApnEOs的檢測,。
3結語
化學發(fā)光免疫分析方法作為一種高選擇,、高靈敏度檢測方法，已經(jīng)被廣泛應用臨床檢測和藥物分析中,。隨著新的發(fā)光試劑,，新固相材料的研制以及新標記技術應用，化學發(fā)光免疫分析方法的靈敏度,，重現(xiàn)性將大大提高,。各種聯(lián)用技術的出現(xiàn)，如毛細管電泳一化學發(fā)光免疫技術的聯(lián)用,，大大提高了化學發(fā)光免疫的選擇性和重現(xiàn)性,。被廣泛應用于臨床檢測和藥物分析中，并朝著自動化,、智能化,、微型化方向發(fā)展。
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